甘蓝型油菜—新疆野生油菜二体异附加系BAC文库的构建

论文摘要

目前作物生产上的杂交育种主要是利用细胞质雄性不育技术,形成不育系、恢复系和保持系三系或不育系、恢复系两系育种,其中油菜品种中约70%为细胞质雄性不育杂种,恢复系是应用此项技术必不可少的条件,如果能够得到恢复基因,就有可能利用此基因建立新的恢复系。而得到恢复基因并深入的研究其功能的有效途径之一就是构建BAC文库。新疆野生油菜（Sinapis arvensis L.）生长势强,抗病虫性好,芥酸及硫甙含量低,具有雄性不育胞质特征,是植物育种中优良的种质资源。本文以含有Nsa细胞质雄性不育恢复基因甘蓝型油菜——新疆野生油菜二体异附加系Nsa恢1的成熟叶片为材料,以CopyControlTMpCC1BACTM（HindⅢCloning-Readyl）Vector为载体,在Zhang和Peterson等人的BAC文库构建方法的基础上改进,建立了一套高效的油菜BAC文库构建技术体系,得到了浓度适当、降解较少的核DNA琼脂糖包埋块,并通过不同浓度梯度酶量酶切实验得到最适合构建文库的酶切条件（1.2U HindⅢ,37℃酶切10min）。通过回收得到浓度、片段大小合适的核DNA酶切片段并建立了高效的连接体系,共得到69120个阳性克隆,94%的插入片段分布在80—230kb之间,76%的插入片段超过100kb,平均插入片段达110kb,相当于甘蓝型油菜基因组大小的6.3倍;筛选到任意基因的概率为99.82%;随机挑选3个大于100kb的克隆进行稳定性继代实验验证。结果表明,所挑选克隆的各代之间的外源片段大小一致,说明BAC克隆在培养的过程中是很稳定的,没有重排现象。并构建完成了BAC一级混合池、二级混合池各一份。该文库的建成,为油菜基因的克隆及基因组学研究提供了技术平台。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 大片段插入文库的研究进展
• 1.2.1 Cosmid文库
• 1.2.2 酵母人工染色体文库
• 1.2.3 细菌人工染色体文库
• 1.2.4 新一代人工染色体系统
• 1.2.5 其它的大片段文库
• 1.3 细菌人工染色体文库构建流程
• 1.3.1 载体（vector）的制备
• 1.3.2 大片段基因组DNA的制备
• 1.3.3 连接和转化和阳性克隆的挑选
• 1.3.4 BAC文库的鉴定和筛选
• 1.4 BAC文库的应用
• 1.4.1 图位克隆目的基因
• 1.4.2 大规模的作图与测序
• 1.4.3 BAC—FISH的应用
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品、菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备和耗材
• 2.2 方法
• 2.2.1 BAC载体的获得
• 2.2.2 大片段核DNA的制备
• 2.2.3 文库的构建
• 2.2.4 文库质量的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 DNA包埋胶块的质量与浓度
• 3.2 最佳酶用量的确定
• 3.3 大量酶切后DNA片段的两次选择
• 3.4 连接与转化
• 3.5 插入片段的检测
• 3.6 大插入片段克隆继代稳定性检测
• 3.7 文库的覆盖率
• 4 讨论
• 4.1 BAC文库构建的经验性结论
• 4.2 BAC文库的筛选方法的选择
• 4.3 下一步工作的设想
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 研究生在读期间发表文章