广西猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因克隆及分子流行病学调查研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。该病自发现以来给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失。2006年夏秋之季,我国部分地区发生猪“高热病”疫情,对养猪业造成巨大损失,发现了高致病性猪繁殖与呼吸综合征变异病毒,证实疫情主要是由该病毒引起的。本研究通过RT-PCR技术对2006月年至2008年2月送检的56份病料进行PRRSV检测,结果30份为阳性,阳性率达54%。本实验对这30份阳性病料作为研究对象,根据北美洲株ATCC-VR2332和中国标准株CH-1a的序列利用Primer设计一对针对ORF3基因的特异性引物GP3-1/GP3-2,通过RT-PCR扩增出约900bp的基因片段,与预期的目的片段大小相符。将其插入克隆载体质粒pMD18-T。构建重组质粒,对克隆的ORF3基因进行序列测定,测序结果显示ORF3基因全长765bp。包含完整的ORF3基因的开放阅读框架,编码254个氨基酸。将ORF3基因序列与VR-2332、FJ04A、JXA1、HuN、LV、VR2332、RespPRRS MLV和CH-1a的ORF3基因进行同源性比较,结果显示,30份毒株的ORF3基因序列之间的核苷酸同源性为90.8%～99.9%,推导编码的氨基酸序列之间的同源性为92.6%～100%;与VR-2332、FJ04A、JXA1、HuN、LV、RespPRRS MLV和CH-1a株的核苷酸同源性分别为87.9～90.0%、89.4%～90.7%、92.1%～99.7%、91.9%～99.4%、40.7%～41.2%、88.2%～89.6%、93.1～96.7%。与VR-2332、FJ04A、JXA1、HuN、LV、RespPRRS MLV和CH-1a株推导编码的氨基酸序列之间的同源性分别为90.2～92.5%、91.3%～93.8%、93.0%～99.7%、93.8%～99.6%、54.9%～56.9%、90.2%～92.5%、95.9～97.6%。表明国内流行毒株的ORF3基因区域变异较大,证实30份毒株均属美洲型。把30株流行毒株与国内外已发表的48株PRRSV相应序列进行比较,并建立了遗传进化树。本研究获得的30株流行毒株均属于3个亚群中的亚群Ⅱ,并且ORF3基因序列的同源性和2006至2007年“高热病”期间分离得到的国内代表株较高,达到了97.7%～99.7%。推导编码氨基酸的比较结果表明,分属于不同亚群的广西不同地区流行的PRRSV毒株在ORF3基因编码蛋白的潜在糖基化位点数7个。分别位于29aa、43aa、50aa、131aa、152aa、160aa、195aa。本研究通过对PRRSV ORF3基因序列变化的比较,了解PRRS的流行状况,探索高致病性猪繁殖与呼吸综合征变异病毒的变异规律,为控制本病流行打下基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一、PRRS病毒病原学
• 二、PRRS病原特征
• 2.1 PRRSV的理化特性
• 2.2 发病机制及病理变化
• 2.3 PRRSV的基因组结构和主要结构蛋白
• 2.3.1 E蛋白
• 2.3.2 M蛋白
• 2.3.3 N蛋白
• 2.4 PRRSV遗传性变异与基因型
• 三、国内外流行状况
• 四、GP3概述
• 五、PRRS疫苗研究进展
• 5.1 减毒活疫苗
• 5.2 灭活苗
• 5.3 亚单位疫苗
• 5.4 基因工程重组疫苗
• 5.4.1 基因疫苗
• 5.4.2 DNA疫苗
• 5.4.3 活载体疫苗
• 六、PRRS病毒的防制技术
• 6.1 一般措施
• 6.2 疫苗接种
• 6.3 使用PRRSV疫苗要注意的问题
• 6.4 净化和扑灭措施
• 七、本研究的目的和意义
• 材料与方法
• 一、材料
• 1.1 PRRS病料
• 1.2 引物
• 1.3 试剂及配制
• 1.3.1 分子生物学试剂
• 1.3.2 制备感受态细胞用试剂的配制
• 1.3.3 培养基的配制
• 1.3.4 质粒提取试剂的配制
• 1.4 仪器
• 1.5 分析所用的PRRSV分离株核苷酸序列
• 二、方法
• 2.1 实验方案
• 2.2 病料阳性鉴定
• 2.3 PRRS病毒RNA的提取
• 2.4 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 2.4.1 反转录（RT）
• 2.4.2 PCR
• 2.4.3 电泳
• 2.5 PCR产物胶回收
• 2.5.1 制胶
• 2.5.2 电泳
• 2.5.3 凝胶块中DNA的回收
• 2.6 感受态细胞的制备
• 2.7 基因克隆
• 2.7.1 目的基因的连接
• 2.7.2 转化
• 2.7.3 抽提质粒
• 2.7.4 重组质粒酶切及PCR鉴定
• 2.8 基因测序
• 2.9 测序结果的处理与分析
• 结果
• 1.病料的采集
• 2.ORF3基因的扩增
• 3.重组质粒的酶切鉴定
• 4.重组质粒PCR鉴定
• 5.核苷酸序列测定结果
• 6.ORF3基因核苷酸序列和其编码氨基酸序列的同源性分析
• 7.遗传进化树分析
• 讨论
• 1.PRRSV的传播途径分析
• 2.PRRSV ORF3基因遗传变异分析
• 3.氨基酸的变异
• 4.抗原表位的变异
• 5.糖基化位点变异
• 6.进化树与流行病学分析
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的论文
• 附录:英文缩写对照表