Caspase 3 siRNA抑制软骨细胞凋亡及治疗骨关节炎研究

论文摘要

[研究背景]骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是最常见的关节疾病,是以关节软骨降解为特征的退行性关节病变。临床上以慢性关节疼痛、僵硬、肿大伴关节功能障碍为主要表现。世界卫生组织（WHO）将OA与心血管疾病和癌症列为三大严重影响健康的疾病。目前,对OA的病因及发病机制仍不是很清楚,其主要涉及关节软骨的代谢障碍、力学功能紊乱等,主要的致病原因与衰老、创伤、遗传和过度使用等因素密切相关。随着年龄的增大,OA患病率迅速上升,研究表明,60岁以上的人群中,50%患有OA；75岁以上的人群患病率达80%；该病最终致残率为53%。我国正步入世界老龄化国家的行列,因而OA逐渐成为影响人们生活质量的严重疾病。目前对OA的治疗分为预防和对症两种,大致分为一般性治疗、药物治疗和手术治疗三大类。其中一般性治疗包括宣传教育、物理治疗、医疗体育锻炼等；药物治疗一般是使用对症的药物,包括非甾体类抗炎药、镇痛剂、糖皮质激素、软骨保护剂等；手术治疗适用于病情较重的病人,包括骨赘切除术、关节固定术、人工关节置换术等。但以上治疗并不能阻止OA病情的发展,因此人们一直在积极寻找更有效的治疗与预防措施。软骨细胞凋亡是目前OA新疗法研究的靶点,如何有效抑制软骨细胞凋亡是当前OA治疗研究的热点。现有的研究多根据软骨细胞的凋亡途径,特别是caspase（半胱氨酸蛋白酶）依赖途径,化学合成一些肽类或非肽类化合物,抑制caspase家族的活性,从而达到抑制软骨细胞凋亡的目的。但这些外源的化合物只能通过物理或化学的作用使caspase蛋白失活,在细胞内部复杂的环境下,化合物容易产生不稳定而影响抑制效果。为此,需要进一步研究出可更有效地抑制软骨细胞凋亡从而治疗骨关节炎的技术。基因沉默技术是其中一个相当有发展前景的技术方向。[研究目的]：本研究使用RNAi干扰技术,设计合成和筛选沉默效率高的caspase 3 siRNA,转染软骨细胞,在软骨细胞内部直接对caspase 3基因进行调控,使其表达受限,不能正确合成caspase 3蛋白,在基因水平抑制caspase 3的表达,阻断凋亡效应的联级反应,从而抑制软骨细胞的凋亡,并通过动物实验,证实caspase 3基因沉默后能达到减缓骨关节炎的发生和发展的目的。[研究方法]：根据基因文库和siRNA的设计原则,设计合成三条caspase 3 siRNA序列,构建pSIH1-H1-copGFP表达质粒,通过基因测序,证实与所设计的序列相同；并利用脂质体（lipofectamine）把pSIH1-H1-copGFP-caspase 3 siRNA转染HSC-T6大鼠肝星状细胞,通过RT-PCR和western blot检测细胞中caspase 3的表达,从而筛选出沉默效率最高的序列。然后使用pPACKH1TM Lentivector Packaging Kit慢病毒包装体系,包装生产含caspase 3 siRNA的慢病毒颗粒,检测慢病毒颗粒的滴度。随后,从大鼠关节软骨分离培养软骨细胞,使用含caspase 3 siRNA的慢病毒颗粒转染软骨细胞,通过RT-PCR和western blot检测软骨细胞中caspase 3的表达,并使用TNF-a诱导软骨细胞凋亡,流式细胞术Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡情况,对比基因沉默组与非基因沉默组抵抗软骨细胞凋亡的能力。接下来,利用Hulth手术,切断前后交叉韧带及内侧副韧带,完整切除内侧半月板,构建骨关节炎动物模型,术后第1、2周在关节内注射caspase 3 siRNA-慢病毒,以激光共聚焦显微镜对关节面大体原位逐层扫描检测基因转染情况；术后第2,4,8周取关节标本,与生理盐水注射组对照,进行组织学评价,包括HE染色和糖胺多糖番红O染色,最后以经典的Mankin评分评价各组OA的发生和发展。[研究结果]：（1）基因测序结果表明所构建的pSIHl-Hl-copGFP-caspase 3 siRNA表达质粒中caspase 3 siRNA的序列与所设计的序列相同；（2）在所设计三条caspase 3 siRNA的序列中,通过转染HSC-T6大鼠肝星状细胞,取细胞作RT-PCR和western blot检测细胞中caspase 3的表达,筛选出caspase 3 siRNA1序列对caspase 3的基因沉默效率最高,约为87%（3）使用pPACKH1TM Lentivector Packaging Kit慢病毒包装体系,能顺利包装生产含caspase 3 siRNA的慢病毒载体颗粒,病毒滴度高达1.08×108ifu/ml。（4） caspase 3 siRNA-慢病毒载体能顺利将caspase 3 siRNA转入软骨细胞,转导率达95%以上；RT-PCR检测软骨细胞中Caspase 3 mRNA的表达和Western blot检测软骨细胞的Caspase 3蛋白表达量时,转染组与对照组的结果有显著性差异（P＜0.001）,基因默率为85%。在使用TNF-a诱导软骨细胞凋亡时,对照组软骨细胞凋亡率是实验组的7倍,即实验组抵抗软骨细胞凋亡的能力是对照组的7倍。（5）在大鼠骨关节炎治疗的体内实验中,慢病毒载体关节内注射能将Caspase 3 siRNA顺利地原位在体转入关节面的软骨细胞中。组织学分析,第8周对照组软骨层缺损并重度纤维化,软骨细胞排列紊乱,软骨基质糖胺多糖大部分失染,Mankin评分为10.0,已达OA中晚期症状；但Caspase 3 siRNA治疗组只是软骨表面不平整并出现轻度纤维化,软骨细胞排列欠规则,软骨基质糖胺多糖着色均匀,Mankin评分为4.25,是OA早期症状。第8周时Mankin评分治疗组与对照组有显著性差异。[结论]：（1）所设计合成的caspase 3 siRNA序列能高效地抑制细胞中caspase 3基因的表达,基因沉效率达87%；（2）利用慢病毒载体可把caspase 3 siRNA高效转染软骨细胞,转染率达95%以上；（3）软骨细胞的caspase 3基因沉默后能有效地拮抗TNF-a诱导的软骨细胞凋亡,拮抗软骨细胞凋亡的能力是对照组的7倍。（4） Caspase 3 siRNA慢病毒载体在大鼠关节内注射可以原位在体转染关节软骨细胞；（5）通过动物实验评价,证实Caspase 3 siRNA治疗组能减缓大鼠骨关节炎的发展。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 1 绪论
• 2 大鼠Caspase 3 siRNA的设计合成和表达载体构建
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 大鼠Caspase 3 siRNA有效序列筛选
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4 Caspase 3 siRNA慢病毒颗粒的包装和生产
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 Caspase 3 siRNA抑制软骨细胞凋亡的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 实验结果
• 5.4 讨论
• 5.6 小结
• 6 Caspase 3 siRNA在治疗动物骨关节炎中的作用探讨
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.3 实验结果
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 7 总结与展望
• 8 参考文献
• 9 索引（中英文对照）
• 10 在学期间发表论文清单
• 11 致谢