论文摘要
目的:研究人外周血来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的体外分离、培养、分化及鉴定方法。观察不同浓度丹参多酚酸盐对体外培养的EPCs的增殖、粘附及NO分泌功能的影响,并探讨其临床意义。方法:采集健康成人外周血,经密度梯度离心法获取单个核细胞（MNCs）,接种在包被有人纤维连接蛋白（ Human Fibronectin ）的培养板上,在加有EBM-2-MV-SingleQuots的培养液中培养、诱导分化和扩增。倒置相差显微镜下观察其形态学变化,并进一步通过激光共聚焦显微镜、免疫组化法测定细胞表面特异性抗原表达情况,鉴定为EPCs后进行下一步实验。激光共聚焦显微镜下DiL-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性的贴壁细胞即为正在分化的EPCs。加入不同浓度丹参多酚酸盐（0.5,2.5,5,10mg/L）干预一段时间,MTT法观察其对EPCs增殖能力的影响,计数贴壁细胞数评价EPCs的粘附能力,硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO含量了解其对EPCs分泌功能的影响。结果:每毫升外周血可得到1—2×106个MNCs。新分离的外周血单个核细胞圆形透亮,悬浮于培养液中。0.4%台盼蓝细胞活力检测显示活细胞数在99%以上。培养第五天左右可见类似“血岛”样的细胞集落。培养七天后梭形贴壁细胞多见,并呈条索状或管状分布。激光共聚焦显微镜鉴定Dil-acLDL、FITC-UEA-1双染色阳性的细胞为正在分化的EPCs;免疫组化显示KDR（即VEGFR-2,又称FLK-1）呈阳性。丹参多酚酸盐作用于EPCs后可促进细胞增殖,增强细胞粘附能力和NO分泌功能,其中5㎎/L丹参多酚酸盐作用最显著,其作用有时间依赖性。结论:利用密度梯度离心法可以从成人外周血单个核细胞中诱导分化出EPCs。丹参多酚酸盐可以促进体外培养的EPCs的增殖并增强其粘附能力和NO分泌功能。丹参多酚酸盐可以改善EPCs的“质”和“量”,这可能是其作为临床防治缺血性疾病有效药物的机制之一。