水稻逆境基因的克隆与相关分析

论文摘要

文献综述部分详细阐述了逆境胁迫下植物体内信号传导的机制。从细胞感受逆境信号及跨膜运输，以及信号在生物体内的传导过程到最后的信号转录调控过程进行了比较详细的讨论，这个过程的复杂性需要多基因共同协调起作用。ABA作为一种激素，能够影响水稻的生长发育及在信号传导中的重要作用，本文对ABA在信号传导机制和对水稻的生理生化方面的影响进行了讨论。 逆境基因的克隆和信号传导研究是当前分子生物学中一个重要而活跃的领域。大量逆境基因通过不同的方法被克隆并进行了功能验证，从生理学和分子生物学方面进行了研究。小G蛋白RAN能够作为分子开关，通过GDP/GTP结合、失活方式将信号从膜外转入膜内，调节着许多细胞代谢途径；远红光修复蛋白对于逆境破坏的光信号通道和电子传递链的修复具有重要的作用；GA响应事件能够为种子萌发提供能量和底物，GA响应蛋白在调控淀粉酶活性和信号传导的磷酸化/去磷酸化过程中发挥重要的作用；核糖体蛋白L24对于核糖体的装配起始过程及合成多肽的过程中发挥重要的作用，核糖体蛋白中的基因属于信号传导的第2通道；植物体的休眠一种复杂的机制，并且同时受ABA和代谢物质如G6PDH等酶的影响，研究发现很多受ABA调控的蛋白激酶和蛋白磷酸化酶参与种子的休眠；Na+/H+逆向转运蛋白参与细胞质内pH、Na+浓度调节及细胞体积变化等生命活动，在赫胁迫下，能够诱导Na+/H+逆向转运蛋白的合成或者激活了原有的无活性的Na+/H+逆向转运蛋白来维持植物体内的渗透压平衡；26S蛋白酶分为ATP依赖型和非ATP依赖型，是真核生物中选择性降解蛋白质的一种泛肽途径，与细胞的DNA修复、胚胎形成、转录调节、细胞程序性凋亡等生理过程有关，并且与ABA关系密切；ABC转运器含有两个高度保守的ATP结合区，它们通过结合ATP发生二聚化，ATP水解后解聚，通过构象的改变将与之结合的底物转移至膜的另一侧。近年来，从不同的生物体克隆到大量的上述相关基因，并且研究了它们的结构及少部分功能，但是除部分基因之外，很多与逆境相关基因的研究还没有涉及；并且同源基因在调控植物的生理功能方面可能也存在很大的差异。因此，克隆、鉴定新的水稻逆境相关基因及研究其生理功能，仍然是目前这个领域具有挑战性的一个重要内容。 本文的研究实验部分以水稻日本晴为材料，利用FDD差异显示技术，结合大矩阵分离方法，获得了900多个差异明显的基因片断，随机选择9个cDNA片断测序，利用水稻生物信息学网站的EST库比对、RACE-PCR和EST拼接后，通过生物信息学预测了这些基因的一些功能，并利用设计的特异引物对不同处理的水稻幼苗进行了RT-PCR初步的功能分析。依据目前研究相对清楚的ABA信号传导途径对克隆的9个基因进行了分类。为深入研究ABA对水稻的生理影响，以水稻愈伤组织为材料，

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 植物对逆境应答的分子机制研究
• 引言
• 1.植物抗渗透胁迫的分子机制
• 1.1 渗透胁迫诱导基因产物及功能
• 1.1.1 第一类基因效应产物
• 1.1.2 第二类基因调控产物
• 1.2 渗透胁迫信号传导和基因表达调控
• 1.2.1 渗透胁迫信号的感受及信号的跨膜传递
• 1.2.2 渗透胁迫信号转导中的第二信使
• 1.2.3 渗透胁迫诱导基因的表达调控
• 1.3 逆境基因克隆的策略及功能验证的方法
• 1.3.1 差异表达基因筛选
• 1.3.2 基因表达的检测
• 2.研究设想
• 第二章 基因克隆及差显分析
• 第一部分 材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 材料及处理
• 1.2 质粒和菌种
• 1.3 工具酶及主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 水稻总RNA提取
• 2.2 水稻RNA检测
• 2.3 mRNA差异显示及基因片段克隆
• 2.3.1 cDNA第一链的合成
• 2.3.2 玻璃粉纯化回收片段
• 2.3.3 连接转化
• 2.3.4 DNA测序
• 2.3.5 RT-PCR分析
• 2.3.6 生物信息学分析
• 2.3.7 cDNA全长的RACE克隆
• 2.3.8 SDS-PAGE原核蛋白表达检测
• 第二部分 结果与分析
• 1.逆境基因的克隆与分离
• 1.1 RNA的提取及检测
• 1.2 荧光差异显示筛选片段
• 1.3 大矩阵筛选差异基因
• 1.3.1 干旱处理后差异显示大矩阵
• 1.3.2 干旱处理后组织特异性表达差异
• 1.3.3 阳性克隆的筛选及转化
• 2.逆境基因的分析
• 第一节 osRAN2基因的分析
• 第二节 一个类远红光修复蛋白基因的克隆与分析
• 第三节 一个类GA响应蛋白基因的克隆与分析
• 第四节 一个水稻核糖体蛋白osL24e相似基因的克隆及表达分析
• 第五节 一个类休眠相关基因os879x008的克隆与分析
• +/H⁺蛋白基因的克隆与分析'>第六节 细胞膜上一个类Na⁺/H⁺蛋白基因的克隆与分析
• 第七节 一个水稻类26S蛋白基因的克隆与分析
• 第八节 一个预测蛋白基因的克隆与功能分析
• 第九节 水稻ABC转运器蛋白基因的克隆与分析
• 第十节 依据ABA信号传导的基因分类
• 第三章 ABA对水稻内部生理物质的影响
• 1.材料与方法
• 1.1 愈伤组织的诱导与处理
• 1.2 碳水化合物的提取和测定
• 1.3 碳水化合物相关酶提取和活性测定
• 2.结果与分析
• 2.1 ABA对水稻愈伤组织内碳水化合物的影响
• 2.2 ABA对培养过程中非还原糖的影响
• 2.3 ABA对水稻愈伤组织中淀粉含量的影响
• 2.4 ABA对水稻愈伤组织内还原糖的影响
• 2.5 ABA对愈伤组织内F/G动态影响
• 2.6 ABA对与糖代谢有关酶活性的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 FDD荧光差异显示技术
• 4.2 逆境基因作用的复杂性
• 4.3 信号传导与ABA的关系
• 4.3.1 不依赖ABA调节的基因
• 4.3.2 依赖ABA调节的基因
• 4.4 逆境基因序列中的互作位点特性
• 4.5 ABA与水稻生理代谢的关系
• 展望
• 参考文献
• 博士在读期间论文发表情况
• 致谢