论文题目: SPR生物传感器用于DNA聚合酶与DNA结合的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微电子学与固体电子学
作者: 吴蕾
导师: 杨梦苏,赵建龙
关键词: 动力学,聚合酶,抑制剂
文献来源: 中国科学院研究生院（上海微系统与信息技术研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 生物分子之间相互作用的动力学过程可以利用表面等离子激元共振(surface plasmon resonance，SPR)生物传感器进行研究。SPR技术克服了传统的生物分子相互作用动力学研究手段的局限性，能够实时地、对生物分子无损伤地检测溶液相的分析物和固定在传感芯片表面的配体之间的相互作用，实验中的分析对象不用标记。论文用SPR生物传感器研究DNA聚合酶和DNA的结合，主要研究了碱基错配对DNA聚合酶和DNA的结合以及DNA聚合酶#DNA#dNMP三元复合物形成的影响，抑制剂对DNA聚合酶和DNA结合的影响。另外，论文介绍了能够进行高通量SPR检测的SPR成像系统(SPM)的研制过程。 论文工作得到以下结果。 1．引物末端一个至多个的碱基错配影响了Taq聚合酶(Taq pol)和DNA模板-引物(DNA T-P)的结合，随错配碱基个数增多Taq pol和DNA的亲和力下降。SPR的动力学分析说明了“正确”的dNMP诱导酶-底物的构象变化，增加了DNA聚合酶(Taq pol、MMLV RT~-)和DNA结合的亲和力常数。“正确”或“错误”dNMP的存在大大增强了pol β和DNA的结合能力。 2．两种脂肪酸(亚油酸和神经酸)结合在人源pol β 8kDa结构域的DNA结合位点，从而竞争性抑制酶和DNA的结合。碳链较长的神经酸抑制酶和DNA结合的能力较亚油酸强。哌酸同样抑制pol β 8kDa结构域和DNA的结合，但是抑制能力较弱。槲皮素也能明显抑制pol β和DNA的结合，作用位点和酶的8kDa和31kDa两个结构域都有关联。 3．失去了核酸酶区域的鼠白血病逆转录酶(MMLV RT~-)和Ⅰ型人源免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1 RT)和DNA的结合都存在构象变化。
论文目录:
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 表面等离子激元共振(SPR)技术
1.1.1 SPR生物传感器的历史
1.1.2 SPR生物传感器原理
1.1.3 SPR生物传感器在生物化学领域的应用
1.1.4 SPR生物传感器的发展趋势
1.2 DNA聚合酶及其抑制剂
1.2.1 DNA聚合酶功能及其分类
1.2.2 DNA聚合酶结构和功能关系
1.2.3 DNA聚合的动力学机制
1.2.4 DNA聚合酶抑制剂介绍
1.2.5 预稳态动力学的研究方法
1.3 本工作的目的和思路
第二章 SPR生物传感器检测聚合酶和DNA相互作用的方法学
2.1 引言
2.2 实验设计
2.2.1 实验设备和材料
2.2.2 DNA固定于传感芯片表面
2.2.3 DNA固定量、流速和传质效应的关系
2.2.4 温度、缓冲液和传感芯片的再生(regeneration)条件
2.2.5 实时检测聚合酶和DNA的结合和解离过程
2.2.6 检测dNMP、抑制剂作用下聚合酶和DNA的结合和解离过程
2.3 SPR数据分析
2.3.1 1：1 Langmuir模型
2.3.2 平行反应模型
2.3.3 构象变化模型
2.3.4 考虑传质效应的1：1 Langmuir模型
2.4 小结
第三章 研究DNA错配以及“正确”或“错误”dNMP对聚合酶与DNA结合的影响
3.1 引言
3.2 实验结果和讨论
3.2.1 末端含有不同错配的DNA T-P固定在SPR传感芯片上
3.2.2 SPR传感芯片表面DNA T-P与Taq pol结合的特异性
3.2.3 Taq pol与完全匹配和末端含有不同错配的DNA T-P的结合动力学分析
3.2.4 dNMP环境中,Taq pol、MMLV RT~-和人源的pol β与DNA T-P的结合动力学分析
3.3 结论
第四章 不同抑制剂对pol β与DNA结合的影响
4.1 引言
4.2 结果和讨论
4.2.1 抑制剂浓度对人源的polβ与不同DNA底物结合的影响
4.2.2 抑制剂作用下人源polβ和DNA T-P的结合动力学分析
4.4 结论
第五章 逆转录酶与DNA的结合以及抑制剂对此过程的影响
5.1 引言
5.2 研究MMLV RT~-和固定在芯片表面的DNA结合以及EFV,NVP和槲皮素对此过程的影响
5.2.1 DNA修饰的传感芯片表面的稳定性和MMLV RT~-结合的特异性
5.2.2 MMLV RT~-与固定于传感芯片表面的不同DNA底物的结合
5.2.3 DMSO对MMLV RT~-与含有8nt空隙的DNA复合物结合的影响
5.2.4 检测不同的化合物对MMLV RT~-与含8nt空隙的DNA T-P复合物结合的影响
5.2.5 结论
5.3 NRTIs和NNRTIs作用下HIV-1 RT和DNA T-P的结合
5.3.1 HIV-1 RT与固定在传感芯片表面的DNA T-P结合的动力学
5.3.2 抑制剂存在情况下HIV-1 RT与DNA T-P结合的动力学
5.3.3 结论
第六章 表面等离子激元共振成像系统的研制
6.1 引言
6.2 SPM硬件和软件系统的研制
6.3 样品池部分的设计
6.4 SPM系统定标
6.4.1 SPM系统信号强度和折射率之间的关系
6.4.2 BIAcoreX信号强度和折射率之间的关系
6.5 小结
第七章 总结与展望
缩略符号说明
参考文献
博士期间发表论文
致谢
个人简历
学位论文独创性声明
学位论文使用授权声明
发布时间: 2006-12-28
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