去分化脂肪细胞的细胞生物学研究

论文摘要

背景组织工程技术的出现为临床上彻底解决组织缺损等难题提供了一条革命性的途径。然而如何获得来源广泛、数量充足、功能良好的细胞,是解决种子细胞问题的关键。近年来,吸脂来源的人脂肪组织来源的干细胞（Adipose derived stemcells,ASCs）成为当今干细胞研究领域的一大热点。但ASCs是位于人脂肪组织内的一个混杂细胞群体。只有大约40%的细胞能向脂肪细胞分化。因此,ASCs并不能满足脂肪组织工程的发展需要。寻找一种分离容易、增殖能力强、成脂分化率高的更优秀的种子细胞仍然是研究热点。脂肪组织内含有多种不同的细胞,主要包含有成熟脂肪细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、组织细胞和干细胞等。大量的脂质聚集使脂肪细胞具有的漂浮性,导致细胞难于体外培养,因此对该细胞的特性研究很少。脂肪细胞由此被认为是处于分化终末期,缺乏增殖能力的一种细胞。国外有研究表明,成熟脂肪细胞在体外培养的过程中,能发生脂质分解变化,重新启动增殖机制,开始分裂增生。我们把这种生理转变称之为脂肪细胞去分化。脂肪细胞去分化将开创细胞生理学一个令人惊喜的领域,改变人们对于组织再生能力的许多观点。然而,关于去分化脂肪细胞的细胞生物学特性研究还很少。本实验中我们尝试从脂肪抽吸物的脂质部分分离纯的成熟脂肪细胞,诱导成熟脂肪细胞去分化,获得去分化脂肪细胞（Dedifferentiated adipocytes,DA）。同时对DA和脂质部分来源的ASCs进行生长动力学、形态学、表面标志物、分化能力和成脂分化率五个方面的鉴定比较。为获得、研究DA提供新的途径,并首次为DA作为脂肪组织工程种子细胞的应用提供实验依据。目的:1、探索从人脂肪抽吸物中脂质部分分离、提纯成熟脂肪细胞,体外培养,以及诱导其去分化,获得去分化脂肪细胞的方法。2、通过与ASCs的比较,于形态学、生长动力学、表面标记物、分化能力及成脂分化率五个方面对DA进行研究,为其广泛应用于组织工程提供实验依据。方法:自成人吸脂术后抽吸物提取成熟脂肪细胞及ASCs,天花板贴壁培养法诱导成熟脂肪细胞去分化,观察细胞形态变化,获得DA。相同的条件下,MTT比色法比较DA、ASCs活性并绘制细胞生长曲线;流式细胞仪鉴定DA、ASCs表面分子的表达;油红O染色、茜素红染色、阿尔辛蓝染色分别鉴定DA、ASCs成脂分化、成骨分化、成软骨分化能力:大体镜下观察、油红O染色分光光度法、油红O染色细胞计数法比较DA、ASCs成脂分化能力。结果:人成熟脂肪细胞在体外培养环境下能去分化为成纤维细胞状DA;MTT比色法测细胞活性:DA、ASCs都有很强的增殖能力,两者无显著性差异;流式细胞仪测定:DA、ASCs中HLA-ABC、CD29、CD44都为阳性,CD45、CD34、CD106都为阴性;成骨分化两周,茜素红染色可见DA、ASCs内出现红色钙盐沉积;成软骨分化两周,阿尔辛蓝染色可见DA、ASCs内软骨基质沉积;成脂分化两周,油红O染色可见DA、ASCs内出现红色脂滴;大体镜下观察显示DA脂滴聚集能力显著大于ASCs;油红O染色分光光度法显示DA在诱导第4天后出现显著性脂滴聚集,ASCs在诱导第10天后才出现显著性脂滴聚集,诱导第12天后DA的吸光值大于ASCs的吸光值,出现显著性差异;油红O染色细胞计数法示DA的平均成脂分化率约为65%,ASCs的约为35%,两者有显著性差异。结论:从成人脂肪抽吸物脂质部分中可以分离、提纯得到大量的成熟脂肪细胞。成熟的脂肪细胞在体外培养条件下可成为DA,DA与ASCs在细胞的生长动力学、形态学、表面标志物和分化能力等方面具有相似的特征,具有很强的增殖活性,表达部分干细胞特征性表面蛋白,有成骨、成软骨分化能力及强大的成脂分化能力,有望成为脂肪组织工程优秀的种子细胞。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 成熟脂肪细胞的分离提纯及其去分化过程
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 去分化脂肪细胞的细胞生物学研究
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三章 去分化脂肪细胞和脂肪组织来源干细胞的成脂分化能力比较
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 综述
• 中英文缩略词对照表
• 攻读学位期间的成果
• 致谢