论文摘要
帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见于老年人的神经退行性疾病。目前其发病机制尚不清楚,但是众多研究显示,线粒体功能障碍在PD发病机制中起了重要作用:线粒体毒素（如MPTP）可以在人类或动物模型引起PD样表现;PD患者的线粒体功能障碍常见;PD致病基因之一的编码产物PINK1蛋白在线粒体上发挥其生物学功能。研究显示,PINK1蛋白定位于线粒体,对线粒体具有保护功能。了解PINK1蛋白的功能对于理解PD的发病机制以及治疗具有重要意义。虽然已经对PINK1蛋白的功能进行了许多研究,目前对其如何发挥保护线粒体功能并不清楚。许多蛋白质通过相互作用参与生物学过程而发挥其功能,因此寻找PINK1蛋白的相互作用蛋白是理解PINK1蛋白功能的一个重要途径。为了寻找可能与PINK1蛋白存在相互作用的蛋白,我们从如下5个方面进行了研究:1.首先应用基因重组技术,以本研究小组前期工作中构建的pcDNA3.1-PINK1为模板,成功构建了野生型PINK1蛋白酵母表达质粒pGBKT7-PINK1。经测序证实PINK1基因阅读框正确,载体构建正确。然后将pGBKT7-PINK1转化到酵母细胞AH109中,应用Western blot技术,检测PINK1蛋白在酵母菌株AH109中的表达情况。结果发现PINK1蛋白能够在酵母菌株AH109中正确表达。2.将27μl MATCHMAKER Human Fetal Brain GAL4 cDNA &genomic libraries原始菌液铺到300个150mm皿中,在30℃温箱中培养24-36小时至菌落融合,刮取菌落,共收集菌液1000ml。使用QIAGEN Tip2500试剂盒抽提1000ml菌液的cDNA质粒,共获得2.593mg文库cDNA质粒。3.采用大规模酵母质粒转化技术,将所抽提的cDNA文库质粒转化至酵母细胞AH109/pGBKT7-PINK1,进行人胎脑cDNA文库筛选。按照文库说明书要求,共进行了4次文库筛选,共筛选了6.65×106个克隆,筛选得到77个His+克隆,继续进行Ade+/Mell+表型检测,我们总共获得了61个Ade+/His+/Mell+克隆。4.61个Ade+/His+/Mell+克隆经过划线、PCR及酶谱分析消除重复克隆,我们获得了49个Ade+/His+/Mell+克隆。通过自激活验证消除能够自激活的克隆,最终我们筛选获得了2个真阳性克隆。经过测序和在NCBI数据库中进行BLAST,这两个真阳性克隆都是已知的蛋白质,它们是KIF1A（kinesin family member 1A）和BAG5（BCL2-associated athanogene 5）。这说明PINK1蛋白可能与KIF1A和BAG5分别存在相互作用。5.由于我们获得的KIF1A序列位于其mRNA的不翻译区,因此认为KIF1A不能作为PINK1蛋白互作蛋白的候选蛋白。而我们筛选到的BAG5序列位于其氨基端编码区,故继续进行了BAG5与PINK1蛋白是否存在互作的验证。收集HEK293A细胞中过表达的HA-PINK1蛋白,与JM109表达的GST-BAG5相孵育,在G4B（Glutathione 4 B）匀浆中进行pull down结合实验,Western blot中应用抗HA抗体作免疫印迹,结果发现在Input及HA-PINK1+GST-BAG5中均见一条63kDa大小的全长型和一条52kDa大小的成熟型PINK1条带;将PKH3-HA-PINK1和pEGFP-N3-BAG5质粒共转染HEK293A细胞,用抗GFP抗体免疫沉淀BAG5蛋白,分别用抗HA抗体和抗GFP抗体做免疫印迹,结果发现在经抗GFP抗体沉淀的蛋白复合物中检测到GFP和GFP-BAG5蛋白,说明免疫沉淀成功;用抗HA抗体做免疫印迹,结果发现共转染细胞组中存在一条63kDa大小的全长型PINK1条带及一条52kDa大小的成熟型PINK1条带。这些结果说明PINK1蛋白与BAG5在细胞体内、外均存在相互作用。继续进行体外结合实验证实PINK1蛋白与BAG5之间的相互作用是直接相互作用。我们首次采用酵母双杂交技术筛选PINK1蛋白的相互作用蛋白,首次发现PINK1蛋白可能与BAG5和KIF1A分别存在相互作用,首次证实PINK1蛋白与BAG5存在直接相互作用。本研究结果不但为进一步深入研究PINK1基因的功能奠定了基础,而且对于我们理解PINK1基因在PD发病机制中的作用、PD的治疗药物的开发以及线粒体功能障碍与PD的关系,甚至是线粒体与衰老的关系均具有重要意义。
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标签：酵母双杂交论文; 帕金森病论文; 蛋白质蛋白质相互作用论文; 免疫共沉淀论文;