苏云金素生物合成基因簇中thu2和thuF基因功能研究

论文摘要

苏云金芽胞杆菌是一类广泛存在于自然界中的能形成芽胞的革兰氏阳性细菌,它能够产生多种生物活性物质对多个种类的昆虫有毒杀作用。苏云金芽胞杆菌已广泛应用于生物农药的开发和转农作物基因来源。苏云金素是由某些苏云金芽胞杆菌产生的对多种昆虫具有杀虫活性的小分子量核苷类活性物质,具有较好的热稳定性,对多个目的无脊椎动物昆虫,以及数种螨类和线虫均有毒性。苏云金素的化学式为C22H32O19N5P,分子量为701 Da,由腺苷,葡萄糖,阿洛糖二酸和磷酸基团组成。本实验室研究小组已经分析预测了高产苏云金素的苏云金芽胞杆菌CT-43菌株中的苏云金素生物合成基因簇中各个基因的功能,并推导了苏云金素的生物合成途径。通过对基因簇中thuE基因的敲除和回补实验,证实了thuE基因与苏云金素的产生密切相关。克隆和表达thuE基因,得到蛋白质ThuE,通过体外催化实验证明ThuE行使磷酸激酶的功能,在前体物C上加上磷酸基团从而合成苏云金素。本论文对苏云金素合成基因簇中的thu2和thuF基因展开了研究。通过生物信息学分析,预测thu2基因编码一种非核糖体肽合成酶,含有腺苷酰化结构域和载体蛋白结构域。推测该非核糖体肽合成酶能结合一分子阿洛糖二酸,起始苏云金素的组装合成。预测thuF基因编码一种糖基转移酶,含有糖基转移酶普遍存在的“天冬氨酸-任何氨基酸-天冬氨酸”模体。推测thuF基因的功能是在阿洛糖二酸与非核糖体肽合成酶形成复合中间体后,催化一分子葡萄糖结合到阿洛糖二酸上,完成阿洛糖二酸与葡萄糖的分子组装。木论文研究用温敏型穿梭质粒pHT304-TS分别构建了thu2基因和thuF基因的插入抗性基因敲除质粒,电转化CT-43感受态细胞后,筛选得到了thu2基因的插入缺失突变体CT-43-22,thuF基因的插入缺失突变体CT-43-F3。对两个突变体的发酵上清液进行HPLC检测,没有发现苏云金素的产生。构建thu2基因的互补质粒pEMB1435和pEMB1436,电转化CT-43-22感受态细胞得到回补重组菌CT-43-22b和CT-43-22c。HPLC结果显示,回补重组菌均能恢复苏云金素的产生。thuF基因的互补实验还有待改进。用表达6×His-tag融合蛋白的载体pET28a分别表达基因thu2和thuF,构建得到了表达载体质粒pEMB1440,pEMB1441和pEMB1442。并分别表达和纯化得到蛋白质Thu2,截短的蛋白质Thu2a和蛋白质ThuF。同时纯化得到磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp。用纯化得到的蛋白质和前体物进行体外酶催化反应。体外催化实验是根据已经推导的苏云金素生物合成途径进行的。第一步催化实验是验证Sfp能否将非核糖体肽合成酶Thu2和Thu2a转化成活化形式；第二步催化实验是在第一步的基础之上,验证活化的Thu2和Thu2a能否与前体物阿洛糖二酸发生结合反应；第三步催化实验是在第二步的基础之上,在Thu2和Thu2a与阿洛糖二酸结合形成前体物A复合体之后,在反应体系中加入糖基转移酶ThuF和葡萄糖基供体UDP-葡萄糖（或其他活化形式的葡萄糖）,验证ThuF是否能将葡萄糖基转运到前体物A复合体上形成前体物B复合体。每一步的催化实验结果还有待用质谱进行检测分析。本研究通过对苏云金芽胞杆菌CT-43中苏云金素生物合成基因簇中的thu2和thuF基因的敲除和互补实验,证明了thu2和thuF基因在苏云金素的生物合成中有决定性作用。本研究还通过生物信息学方法分析和预测了thu2和thuF基因的功能,克隆并表达得到了蛋白质Thu2,Thu2a和ThuF,并建立了体外催化实验反应的体系,为下一步的研究工作奠定了坚实的实验基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.2 苏云金素的介绍
• 1.3 苏云金素合成基因簇研究进展
• 1.4 非核糖体肽合成酶简介
• 1.5 糖基转移酶简介
• 1.6 本课题的研究意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株,质粒和引物
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA常规操作
• 2.2.1.1 大肠杆菌质粒DNA提取
• 2.2.1.2 苏云金芽胞杆菌总DNA的提取
• 2.2.1.3 DNA的体外重组操作
• 2.2.1.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.1.5 苏云金芽胞杆菌感受态细胞的制备和电转化
• 2.2.2 基因敲除载体质粒的构建
• 2.2.2.1 thu2基因敲除载体质粒的构建
• 2.2.2.2 thuF基因敲除载体质粒的构建
• 2.2.3 基因敲除突变体的筛选
• 2.2.4 基因的互补试验
• 2.2.5 蛋白质表达和纯化
• 2.2.5.1 基因表达载体质粒的构建
• 2.2.5.2 目的蛋白质的表达和纯化
• 2.2.5.3 蛋白质的SDS-PAGE
• 2.2.6 苏云金素的分离纯化和HPLC检测
• 2.2.7 晶体和芽胞的显微镜观察
• 2.2.8 基因注释及序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 Thu生物合成基因簇序列的进一步分析
• 3.2 基因thu2功能的分析
• 3.2.1 thu2基因的注释和生物信息学分析
• 3.2.2 thu2基因敲除载体的构建
• 3.2.3 thu2基因敲除突变体的筛选
• 3.2.4 thu2基因突变体的表型检测
• 3.2.5 thu2基因的互补试验
• 3.2.6 thu2基因的原核表达和蛋白质纯化
• 3.2.6.1 不同培养时间对蛋白Thu2表达的影响
• 3.2.6.2 不同IPTG浓度对蛋白Thu2表达的影响
• 3.2.6.3 不同诱导温度对蛋白Thu2表达的影响
• 3.2.7 体外分析Thu2的功能
• 3.3 基因thuF功能的分析
• 3.3.1 thuF基因的注释和生物信息学分析
• 3.3.2 thuF基因敲除载体的构建
• 3.3.3 thuF基因敲除突变体的筛选
• 3.3.4 thuF基因突变体的表型检测
• 3.3.5 thuF基因的互补试验
• 3.3.6 thuF基因的原核表达和蛋白质纯化
• 3.3.7 体外分析ThuF的功能
• 4 讨论
• 4.1 关于苏云金素合成基因簇
• 4.2 关于苏云金素的生物合成途径
• 4.3 关于苏云金素合成基因簇中基因的功能
• 5 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录