酵母异源表达瑞氏木霉纤维素酶特性研究

论文摘要

乙醇最有发展前景的可再生液体燃料。面对世界人口的急剧膨胀和粮食短缺,用粮食生产酒精的发展将受到限制。近年来,利用重组酵母直接生物转化纤维素生成酒精,由于其工艺设备简单、成本低而被认为具有良好的发展前景,并成为世界各国近年来重点研究的方向。酵母由于其转化和表达的高效性是一种良好的异源表达宿主,许多来源于真菌的纤维素酶已经被表达于酿酒酵母中,并获得了具有活性的重组酶蛋白。然而酵母表达外源纤维素酶基因的水平非常有限,酶活也存在较大幅度的下降。其中,纤维素酶系的主要组分之一Ce17A（占瑞氏木霉分泌纤维素酶60%的质量分数,为作用于纤维素结晶区的关键酶）,在酿酒酵母和毕赤氏酵母中的表达被发现是高度糖基化的,有的没有活性（Hong J et al.2003）,有的较野生型酶的酶活有较大程度的下降（Lynd LR et al.2002:Godbole S et al.1999;Boer H et al.2000）。而纤维素酶酶系中重要的内切酶Ce15A,在酵母中异源表达,表达量较其来源的瑞氏木霉,存在着大幅度的下降（肖志状等2001）。本文通过瑞氏木霉纤维素外切酶Ce17A的四个N-糖基化位点突变子分别在毕赤氏酵母的表达,比较研究了Ce17A高糖基化对酶在酵母中表达酶活力的影响,并得到Ce17A异源表达酶活提高的突变体酶;构建了酿酒酵母致突变菌,并将表达有瑞氏木霉纤维素内切酶Ce15A的酿酒酵母致突变菌进行定向筛选,得到了纤维素酶内切酶Ce15A异源酶表达量提高的突变菌株。这不仅提高了纤维素酶在酵母宿主中的异源表达的酶活和酶表达量,也为蛋白质在酵母中的蛋白工程改造提供了有用的信息与平台。本论文的主要研究成果如下:1.Ce17A在毕赤氏酵母中异源表达N-糖基化的研究。通过点突变对Ce17A的N-糖基化位点进行改造,将45、64、270和384位四个N—糖基化位点的天冬酰胺突变为丝氨酸,构建重组质粒并将其在P.pastoris中进行表达,获得单独表达外切纤维素酶的酵母菌株,以此来研究高糖基化对Ce17A在酵母表达中的影响。研究证明,Asn64位的糖基化对毕赤酵母中表达的Ce17A酶活力影响较大,此位点的突变使rCe17A的酶活提高了7倍。对Ce17A及其四个N-糖基化位点的三级结构进行分析,结果表明Ash64基本上处于蛋白内部,残基周围可容纳糖基化的空间很小。Ash64残基若要被糖基化,至少会显著改变局部结构,甚至可能影响整体结构和酶活。另外,rCe17A N64S突变体的酶活仍然远低于野生型,这说明Asn64位的糖基化可能只是影响Ce17A在毕赤酵母中表达后活性的一个方面。蛋白质折叠机制的差异和共翻译糖基化对Ce17A二硫键和tunnel结构的形成具有重要影响。2.致突变菌的构建和Ce15A高表达突变子的获得。成功通过ctt1,sod1,srx1三个氧化损伤清除基因的敲除,构建了三株致突变菌株,RDKY3615（ΔCTT）、RDKY3615（ΔSOD）和RDKY3615（ΔSRX）,测定了致突变菌的生长情况和对H2O2的敏感性,并通过报告质粒中kanamycin抗性基因的回复突变,确定了H2O2浓度和处理时间对突变率的影响。将Ce15A在致突变菌RDKY3615（ΔCTT）和RDKY3615（ΔSOD）中表达,经双氧水处理和大量的CMC双层平板筛选,获得了一系列大水解圈突变株。经过液体发酵和上清液总酶活的测定,筛选出15株酶活较野生型明显提高的菌株,其中RDKY3615（ΔCTT）-Ce15A突变株11株,RDKY3615（ΔSOD）-Ce15A突变株4株,最高相对酶活较野生型提高了10.1倍。经过蛋白质的定量和比酶活的计算,发现所得高酶活突变株,其总酶活的提高是由于Ce15A表达量的提高。测序结果表明,Ce15A基因本身并没有发生突变,突变菌株酶活的提高是由于酿酒酵母基因组发生了可遗传的突变。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 纤维素酶
• 1.1.1 纤维素酶的命名
• 1.1.2 纤维素酶的性质,与瑞氏木霉的纤维素酶
• 1.2 纤维素酶在酵母中的异源表达
• 1.2.1 纤维素酶在酿酒酵母中表达
• 1.2.2 纤维素酶在毕赤氏酵母中表达
• 1.3.纤维素外切酶Cel7A在酵母中异源表达的N-糖基化情况
• 1.3.1 瑞氏木霉中Cel7A的糖基化
• 1.3.2 Cel7A在酵母中的糖基化
• 1.4 致突变菌
• 1.5 本研究的目的与主要工作内容
• 第二章 外切纤维素酶Cel7A的糖基化位点改造
• 2.1.材料与方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 培养基和溶液
• 2.1.4 菌种活化,提取质粒
• 2.1.5 点突变引物的设计
• 2.1.6 点突变方法
• 2.1.7 Cel7A基因及其突变体N45S/N64S/N270S/N384S的PCR扩增条件
• 2.2 结果与讨论
• 结论
• 第三章 Cel7A及其突变体在毕赤酵母中的表达与研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 工具酶、试剂和仪器
• 3.1.3 培养基和溶液
• 3.1.4 载体质粒pPIC9K的提取,目的基因与载体的限制性内切酶消化反应
• 3.1.5 线状载体质粒pPIC9K的去磷酸化处理,目的基因与载体的连接反应
• 3.1.6 连接液的乙醇沉淀
• 3.1.7 大肠杆菌感受态细胞的制备,电击转化
• 3.1.8 大肠杆菌转化子的验证
• 3.1.9 重组质粒的线性化
• 3.1.10 毕赤酵母电转化
• 3.1.11 外源蛋白的诱导表达
• 3.1.12 胞外蛋白表达情况的SDS-PAGE检测
• 3.1.13 酶活性测定
• 3.1.14 粗酶液的制备
• 3.1.15 超滤浓缩
• 3.1.16 离子交换层析
• 3.1.17 Cel7A的三级结构模拟,残基暴露表面积和相邻残基数目的计算
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 Cel7A及其突变体在酵母中异源表达的重组质粒的构建
• 3.2.2 Cel7A及其突变子在毕赤氏酵母中表达与酶活的比较研究
• 3.2.3 Cel7A及其四个糖基化位点的三级结构分析
• 结论
• 第四章 酿酒酵母致突变菌株的构建及性质研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 工具酶和试剂
• 4.1.3 培养基和溶液
• 4.1.4 敲除片段获得和纯化
• 4.1.5 敲除片断电转化酿酒酵母
• 4.1.6 转化子验证
• 4.1.7 致突变菌株生长情况的测定
• 2O₂浓度诱导条件下致突变菌株存活率的测定'>4.1.8 不同H₂O₂浓度诱导条件下致突变菌株存活率的测定
• 4.1.9 构建kanamycin抗性报告质粒
• 4.1.10 致突变菌株kanamycin抗性回复突变率的测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 致突变菌株构建
• 4.2.2 致突变菌的生长情况研究
• 4.2.3 不同浓度双氧水处理下的RDKY3615（△CTT）和RDKY3615（△SOD）的存活率
• 4.2.4 回复突变率测定的kanamycin抗性报告质粒的构建
• 4.2.5 kanamycin抗性基因回复突变率的测定
• 结论
• 第五章 Cel5A在致突变菌株中的突变与高酶活突变株的筛选
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 工具酶、试剂和仪器
• 5.1.3 培养基和溶液
• 5.1.4 表达质粒pGADT7—Cel5A的构建,酶切验证
• 5.1.5 pGADT7—Cel5A转化酿酒酵母致突变菌株
• 5.1.6 SDS电泳检测发酵液中内切酶
• 5.1.7 活性染色
• 5.1.8 双氧水处理突变
• 5.1.9 刚果红染色平板筛选高酶活突变株
• 5.1.10 内切酶酶活性测定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 瑞氏木霉内切纤维素酶Cel5A在致突变菌中的表达
• 5.2.2 表达有Cel5A的大水解圈致突变菌突变子的筛选
• 5.2.3 表达有Cel5A的大水解圈致突变菌突变子的酶活性测定
• 5.2.4 致突变菌发酵液的SDS电泳与活性染色
• 5.2.5 高酶活突变子的比酶活比较及基因测序
• 结论
• 全文总结与展望
• 1 本论文取得的创新性结果
• 2 本论文存在的问题及深入方向
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表