人类原发性膝关节骨性关节炎病变滑膜全基因组表达与分析

论文摘要

研究背景原发性膝关节骨性关节炎（KOA）又称特发性膝关节骨性关节炎,是老年人常见的一种退行性关节疾病。流行病学调查显示,国内该病的发病率为5%,而60岁以上者更是高达15-20﹪。随着世界人口老龄化,本病的发生率在全球范围内呈现逐年上升趋势,研究该病的病因、发病机制,并有效的进行预防和治疗已成为全球骨科学界的重要课题。一般认为,KOA的发病与年龄、性别、肥胖、遗传、激素、运动、创伤、职业等多种因素密切相关。其发病是在力学和生物学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨三者降解和合成的正常偶联失衡的结果,基本特征是关节软骨破坏或变性产生的关节病变。临床上以膝关节疼痛、僵硬、活动受限、活动时可有摩擦响声为特征,病变累及骨、关节软骨、滑膜及关节周围支持结构。早期表现为关节疼痛,中期出现退变性膝内翻或膝外翻,晚期全关节间隙消失,伴屈曲畸形。KOA的诊断通常是依靠临床表现和放射线检查。然而,在KOA的早期并不能通过放射线检查发现关节软骨的变化,因为在放射线检查能够发现软骨有改变之前,软骨一定在分子代谢和超微结构上发生了非常显著的变化。滑膜是关节滑动体系中的重要组成部分,其中有大量的血液供应和丰富的神经供应,滑膜的分泌、吸收和营养供应是关节软骨维持正常代谢和功能的前提。研究发现,在KOA中,病变关节滑膜细胞凋亡远较正常组增强。此前的众多对KOA发病机制的研究多以关节软骨为对象,而本项研究在全球范围内首次应用全基因组表达谱芯片技术对人类正常膝关节滑膜及原发性KOA病变滑膜进行了研究与分析。研究目的尽管在最近十年来作出了很多努力,但是,原发性KOA的主要发病机制仍然不十分明了,而且没有针对的治疗办法。因此本项研究,目的在于通过人类原发性KOA病变滑膜全基因组基因谱的表达以鉴定与本病相关的全部差异表达基因,根据基因功能的改变情况,探讨其与本病发生的内在联系,并研究潜在的治疗目标。为原发性KOA的基因治疗打下坚实的基础。与此同时,对部分差异基因进行复孔的实时定量PCR验证,目的是进一步验证所获得的差异基因在原发性KOA病理过程中的意义。研究方法1、本次共对16例膝关节滑膜样本进行了实验研究,其中,原发性KOA病人12例,根据纳入标准及排除标准选择。实验用滑膜全部于膝关节镜手术和人工膝关节置换术中获得。并根据Kellgren和Laurence放射学分级标准将每4个病人的滑膜样本分为一组,分为轻（A3）、中（A4）、重（A5）三组;将4例健康人的膝关节滑膜样本分为B1组。2、RNA样品制备（1）.两相分离（2）.RNA沉淀（3）.RNA清洗（4）.重新溶解RNA沉淀（5）.RNA质量检测3、aRNA样品标记和合成（1）.cDNA合成（2）.cDNA第二链合成（3）.aRNA合成（4）.aRNA纯化（5）.aa-UTP aRNA间接标记（6）.质量控制4、芯片预杂交5、杂交6、洗片7、结果扫描,数据读取8、合成的cDNA用于实时定量PCR9、进行Realtime PCR反应研究结果我们对所有16例实验样本分别进行了全基因组芯片分析,在每张芯片上所拥有的40000个点上, 16例样本所共同拥有的31080个基因得到表达,而每个样本中又会含有少量与其它样本不同的基因。按照预先的分组,在31080个共有基因范围内,对每个组内每个对应基因运算其均量,将每组样本转变为一个个体（即A3、A4、A5、B1四组）,进行组间比较。首先,我们将病变组（A3、A4、A5三组）分别与健康组（B1）进行比较,找出三组中共同的差异表达基因。通过本次实验,在31080个共有基因范围内,鉴定出很多差异表达的基因,而具有统计学意义的差异基因共73个,其中:2倍上调的基因46个,4倍上调的基因10个,8倍上调的基因5个;2倍下调的基因27个,4倍下调的基因3个,8倍下调的基因1个。包括我们十分期待的合成代谢和分解代谢矩阵基因功能调节的变化。尤其重要的是氧化防御基因的下调节,过氧化物歧化酶2和3,和谷胱甘肽过氧化物酶3尤其突出。这表明在骨性关节炎细胞和矩阵的连续氧化应激是一个主要的潜在发病机理。与细胞表型稳定性相关的基因,在原发性KOA的关节滑膜中显著减少,说明它的出现受到抑制,是加速关节退化的另一因素。第二,病变组组间比较:试图通过比较找到轻、中、重度KOA滑膜中基因表达的差异,然而我们发现,这73个差异基因,在病变组间的表达没有显著差异。根据科学实验结果可以重现的原则,对任意选定的5个差异基因进行了复孔的PCR实时定量检测,通过三次的重复实验,我们发现,三次的结果惊人的一致,经统计学处理,全部是:P<0.001,有显著性差异,进一步证实了膝关节滑膜组织中的差异基因在原发性KOA发生过程中的关键作用。结论1、膝关节滑膜中的差异表达基因是原发性膝关节骨性关节炎发生与发展的重要原因。2、原发性膝关节骨性关节炎发生与发展的差异基因及其功能不因病情轻重的变化而变化。3、参与合成代谢的相关基因功能下调与参与分解代谢的相关基因功能上调加速了膝关节滑膜的退化,进而加速了全膝关节的退变进程。4、与免疫相关基因功能的上调使位于滑膜中的吞噬细胞过度活跃,导致破坏与修复的平衡代谢被打破,进而使膝关节滑膜、软骨等结构遭受破坏。5、与信息传递相关基因功能的下调使膝关节滑膜代谢的协调性被打破而出现代谢紊乱,进而导致膝关节代谢紊乱。6、多基因联合作用导致了原发性膝关节骨性关节炎的发生与发展。

论文目录

中英文名词术语对照

英文摘要（Abstract）

中文摘要

前言

第一部分理论研究与探讨

一、原发性膝关节骨性关节炎（KOA）的现代医学研究进展

（一）原发性膝关节骨性关节炎的流行病学研究概况

（二）原发性膝关节骨性关节炎的病因学研究概况

（三）原发性膝关节骨性关节炎的病理学研究概况

1. 原发性膝关节骨性关节炎软骨的改变

2. 原发性膝关节骨性关节炎软骨下骨的改变

3. 原发性膝关节骨性关节炎滑膜的改变

（四） . 原发性膝关节骨性关节炎的发病机制研究进展

1. 原发性膝关节骨性关节炎软骨退变机制的几种学说

2. 原发性膝关节骨性关节炎软骨退变的分子生物学机制研究概况

（五）实验室检查进展

1. 关节液

2. 血液

3. 尿液

（六）现代医学诊断标准与常规治疗进展

1. 诊断标准的进展

2. 治疗方法的进展

二、原发性膝关节骨性关节炎的中医药研究进展

（一）骨性关节炎与“痹证”

1. 痹证说起源

2. 痹证说的演变与发展

（二）祖国医学对原发性骨性关节炎病因病理的认识

1. 传统中医对原发性骨性关节炎病因病理的研究概况

2. 现代中医对原发性骨性关节炎病因病理的研究进展

（三）原发性膝关节骨性关节炎的中医药治疗现状

1. 中医药防治原发性膝关节骨性关节炎机理的研究概述

2. 原发性膝关节骨性关节炎中医药治疗方法研究进展

三、原发性膝关节骨性关节炎的基因治疗研究进展

1. 基因治疗的兴起

2. 基因治疗的概念和种类

3 基因治疗的策略

4. 目的基因的选择

5. 基因转移载体的选择

6. 受体细胞的选择

7. 基因转移方式的选择

8 基因表达的调控

9. 基因研究的前景展望

第二部分原发性膝关节骨性关节炎多基因致病假说

一、假说

二、假说的理论性论证

（一）基因程控学说的启示

（二）基因组学与后基因组学

（三）关于基因组进化与生物进化的启发

（四）基因表达谱的研究与发展提供了条件

1. 基因表达连续分析法

2. 微阵列法

3. 全基因组芯片技术及应用

第三部分实验研究

一、临床资料收集

（一）原发性膝关节骨性关节炎临床病历选择

1. 纳入标准

2. 排除标准

（二）正常膝关节滑膜（病历）选择

1. 纳入标准

2. 排除标准

（三）实验用滑膜收集

1. 原发性膝关节骨性关节炎病变滑膜采集与分组

2. 正常膝关节滑膜采集

二、实验一：膝关节滑膜（病变及正常）全基因组基因谱表达

（一）目的

（二）试剂和仪器

（三）实验步骤

1. RNA样品制备

2. aRNA样品标记和合成

3. 芯片预杂交

4. 杂交

5. 洗片

6. 结果扫描，数据读取

（四）结果

三、实验二：实时定量（PCR）验证基因表达的变化

（一）目的

（二）试剂和仪器

（三）实验步骤

1. 样品的RNA 抽提

2. DNA 质量检测

3. 使用样品的RNA 进行cDNA 合成

4. 合成的cDNA用于实时定量PCR

5. 实时定量PCR 使用引物的列表

6. 梯度稀释的标准品及待测样品的待测基因实时定量 PCR 结果

7. 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（内参）实时定量 PCR 结果

8. 各样品目的基因量以内参校正的计算结果

（四）结果

第四部分总结与讨论

一、总结与讨论

二、本项研究创新点

三、存在的问题

四、前瞻性分析

第五部分全文结论

参考文献

综述

附件及附图

个人简历

致谢

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