几株IBV弱毒对流行毒株CK/CH/LDL/97I的免疫保护作用评价

论文摘要

鸡传染性支气管炎活疫苗在鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV）的防制过程中起着重要的作用。在我国,除引入的马萨诸塞（Massachusetts）血清型疫苗H120, H52外,还有许多由地方分离株通过鸡胚致弱制备的商品化活疫苗被用于IBV的防制,而且大多数疫苗的分子背景不清楚。鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus, IBV）血清型众多,不同血清型之间交叉反应小或不具有交叉反应性,因此世界各国均选择与本地区流行血清型相匹配的毒株进行鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis, IB）弱毒疫苗的研制。为了调查我国IBV疫苗株的来源和进化及其与IBV分离株之间的系统发育关系,我们选择了5株具有代表性的鸡传染性支气管炎活疫苗（JAAS, H120, IBN, Jilin, J9）和3株鸡传染性支气管炎致弱毒株CK/CH/LHLJ/04ⅤF110、tl/CH/LDT3/03 F120和CK/CH/LDL/97ⅠF115和当地流行毒株CK/CH/LDL/97Ⅰ作为研究对象,对其S1基因进行序列比对分析,通过序列比较,分析疫苗株与参考株相应基因之间的序列同源性;根据结构蛋白基因和非结构蛋白基因的核苷酸序列构建系统发育树,分析疫苗株与参考株之间的系统发育关系,同时阐明我国IBV的基因型,探讨我国IB流行的背景和原因。IBV S1蛋白能诱导机体产生病毒中和抗体、血凝抑制抗体,在病毒致病性和组织嗜性等方面均具有重要作用,因此目前对于IBV致病力的研究主要集中于S1基因。首先对不同毒株及参考毒株的S1基因进行比较和系统进化树分析,研究了CK/CH/LDL/97Ⅰ与其他病毒的基因型关系。证明CK/CH/LDL/97Ⅰ属于有别于其它IBV毒株的一个独立的基因群。在此基础上,通过血清抗体检测、攻毒后发病率、死亡率、临诊症状、病理变化观察以及气管和肾脏中病毒分离等方面研究了同种致弱毒株和异种致弱毒株对CK/CH/LDL/97Ⅰ的免疫效力。对其S1基因进行序列比对分析,结果表明疫苗株与流行毒株的核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别不超过76.4%和78.7%。其氨基酸系统发育进化树分析发现,CK/CH/LDL/97Ⅰ与Q1、J2、T3属一个群。以上结果表明:CK/CH/LDL/97Ⅰ与Q1、J2、T3属于我国近年出现的一种新的基因型IBV。根据IBV疫苗株S1基因的系统发育关系,选择5株最具有代表性的疫苗（JAAS, IBN, Jilin, H120, J9）和3株鸡传染性支气管炎致弱毒株（CK/CH/LHLJ/04ⅤF110、tl/CH/LDT3/03 F120、CK/CH/LDL/97ⅠF115）进行免疫保护试验。180只SPF白莱航鸡随机分成9组（20只/组）,饲养在负压隔离器中。在15日龄时分别用此8株弱毒苗经滴鼻途径对1-8组鸡进行免疫接种,第9组鸡用作阴性对照。从免疫后20天,用间接ELISA能从所有免疫鸡的血清样品中检测到抗体,证明此5株商品疫苗和3株人工致弱毒均可刺激机体产生体液免疫应答。在35日龄时,用异种分离株CK/CH/LDL/97Ⅰ对所有试验鸡进行攻毒。攻毒后3天,部分免疫鸡群开始出现IB的临床症状,发病率为0～100%、死亡率为0;非免疫鸡群的发病率为100%,死亡率为10%。死亡的免疫鸡和非免疫鸡的病理变化主要表现为:肾脏肿大、苍白,肾小管和输尿管有白色的尿酸盐沉积,外观呈现典型的“花斑肾”。攻毒5d后每组随机扑杀10只鸡,采集器官,应用RT-PCR法检测病毒,气管样品病毒检出率为50%～90%,肾脏样品病毒检出率为10%～30%。然而,同种致弱毒株CK/CH/LDL/97ⅠF115对CK/CH/LDL/97Ⅰ强毒的攻击可提供100%的临诊和病毒分泌的保护性。由此可见:我国目前使用的主要活疫苗对异种IBV分离株的感染不能提供完全的保护作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 鸡传染性支气管炎概述
• 1.2 鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学研究进展
• 1.2.1 鸡传染性支气管炎病毒生物学分类地位
• 1.2.2 鸡传染性支气管炎病毒基因组结构
• 1.2.3 鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白
• 1.2.4 鸡传染性支气管炎病毒的分子变异
• 1.3 鸡传染性支气管炎疫苗的研究进展
• 1.3.1 IB 灭活苗
• 1.3.2 IB 弱毒疫苗
• 1.3.3 IB 基因工程疫苗
• 1.3.4 IB 活疫苗存在的问题
• 1.4 研究目的和意义
• 1.5 研究内容和方法
• 2 材料与方法
• 2.1 病毒
• 2.2 鸡外周血红细胞、SPF 鸡胚、SPF 雏鸡
• 2.3 载体与受体菌
• 2.4 主要试剂
• 2.5 主要仪器设备
• 2.6 引物
• 2.7 病毒增殖
• 2.8 红细胞凝集试验
• 2.9 电镜检测
• 2.10 RT-PCR 检测
• 2.10.1 病毒RNA 的提取
• 2.10.2 反转录
• 2.10.3 聚合酶链式反应
• 2.11 PCR 产物的纯化回收
• 2.12 PCR 产物的连接与转化
• 2.13 重组质粒提取、鉴定及序列测定
• 2.13.1 碱裂解法提取质粒
• 2.13.2 重组质粒的鉴定
• 2.13.3 序列测定
• 2.14 基因序列确定及分析、比较
• 2.15 IB 疫苗及致弱株对异种IBV 分离株的保护评价
• 2.15.1 疫苗毒半数鸡胚感染量（EID50）的测定
• 2.15.2 实验设计
• 2.15.3 免疫鸡血清的抗体检测
• 2.15.4 免疫鸡攻毒后器官的采集及病毒的分离
• 3 结果
• 3.1 商品疫苗毒及致弱毒致鸡胚病变特征
• 3.2 红细胞凝集试验
• 3.3 电镜检测结果
• 3.4 RT-PCR 检测结果
• 3.4.1 CK/CH/LDL/97ⅠN 基因的鉴定
• 3.4.2 CK/CH/LDL/97ⅠS1 基因的扩增、回收及质粒鉴定
• 3.5 CK/CH/LDL/97ⅠS1 基因推导的氨基酸序列分析
• 3.6 病毒毒价（EID50）测定结果
• 3.7 免疫鸡群的抗体检测
• 3.8 攻毒试验
• 3.9 气管和肾脏的病毒分离
• 4 讨论
• 4.1 病毒增殖及鉴定
• 4.2 CK/CH/LDL97ⅠS1 基因的同源性分析
• 4.3 对异种IBV 分离株的保护评价
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 附录A
• 附录B