水稻T-DNA插入突变体的筛选和SDP1基因功能分析

论文摘要

目前，利用突变体克隆功能基因的方法被广泛采用。本研究采用正向遗传学方法克隆基因，即通过对水稻Enhancer trap系T1代T-DNA插入突变体的筛选，获得带有T-DNA插入的突变家系，通过分离突变家系侧翼序列，寻找侧翼序列与突变表型共分离家系，为基因分离与克隆奠定基础。并对一个半矮、晚抽穗、叶色淡绿突变体sdp1（semi-dwarf，delayed flowering，pale green 1；相应功能基因SDP1）的基因功能和农艺性状进行了初步研究，主要实验结果如下：1．2005年对T-DNA插入突变体T1代约2，000个家系筛选，结果显示：苗期和大田总突变频率分别为4.40％、13.42％，主要突变表型有：白化、黄化、假病斑、矮化，少分蘖、株型披散、早衰、晚抽穗等。并对突变家系进行了T-DNA插入和突变表型的初步共分离检测，得到126个表型明显PCR阳性家系。通过TAIl-PCR、反向PCR、质粒拯救等方法，总共分离侧翼序列142条，对这些序列进行了Blastn分析和侧翼序列与突变表型的共分离验证。2．对sdp1突变体侧翼序列进行生物信息学分析，确定T-DNA插入在第3染色体，目标基因SDP1（OS03g63050）功能未知，该基因全长809 bp，包括3个外显子，T-DNA插入在此基因终止密码子后8 bp。对T3代进行遗传稳定性分析，证明了侧翼序列与突变表型仍是共分离的。通过Southern杂交，得出sdp1突变体是T-DNA单拷贝插入。对互补载体（陈志辉构建转化）植株T0代进行表型观察和检测，结果表明表型恢复率（野生型SDP1基因能恢复sdp1突变体的表型）为24.36％，从而对SDP1基因的功能进行了验证。通过对Enhancer trap载体（pFX-E24.2-15R）上GUS基因染色，观察到GUS在突变体的苗期、分蘖期、抽穗期的根、茎、叶、叶鞘及颖花的外稃均有表达。RT-PCR未检测到SDP1基因在苗期、分蘖期、抽穗期的根、茎、叶、叶鞘等部位的表达。构建成pSDP1∷GFP的融合表达载体并转化中花11。对抽穗期的色素含量进行了测定，结果表明突变体叶色淡绿是由于Chl含量的下降及Car含量的升高引起的。对中花11、sdp1野生型、杂合体和突变体生长的各个时期进行株高的测定，得出四者株高随时间变化的趋势，确定SDP1基因对发芽后23天的植株株高已产生影响。并对中花11、sdp1野生型、杂合体和突变体主要农艺性状进行考种，结果表明野生型与突变体在株高、结实率、千粒重等方面都存在明显的差异，第一二茎节长度的变化是引起株高差异的主要原因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1. 水稻基因组学研究现状
• 2. 水稻 T-DNA插入突变体库的构建
• 2.1 T-DNA转移和整合的特性
• 2.1.1 T-DNA转移的特性
• 2.1.2 T-DNA整合的特性
• 2.2 T-DNA插入突变的几种策略
• 2.2.1 基因敲除（Gene knock-out）技术
• 2.2.2 基因捕获（Gene trap）技术
• 2.2.3 激活标签（Activation tagging）
• 2.2.4 多功能标签
• 3. 水稻 T-DNA插入突变体侧翼序列的分离
• 3.1 热循环不对称 PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，简称TAIL-PCR）
• 3.2 反向PCR（Inverse PCR）
• 3.3 质粒拯救（Plasmid rescue）
• 3.4 几种分离侧翼序列方法的比较
• 4. T-DNA插入突变在水稻功能基因组学研究中的应用现状
• 5. 矮化的机理及矮化重要基因的克隆
• 5.1 水稻矮秆性状的遗传研究
• 5.2 水稻植株矮化机制研究
• 5.2.1 水稻植株矮化与植物激素的关系
• 5.2.1.1 参与调控水稻植株高矮的GA相关基因的克隆
• 5.2.1.2 参与调控水稻植株高矮的BR相关基因的克隆
• 5.2.2 其它类型的植物矮化突变体
• 6. 本研究的研究目的、意义和创新之处
• 6.1 本研究的研究目的
• 6.2 本研究的意义
• 6.3 本研究的创新之处
• 第二章 T-DNA突变体材料的筛选和侧翼序列的分离
• 1. 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要设备
• 2. 方法
• 2.1 DNA小样抽提（CTAB法）
• 2.2 DNA大样抽提（CTAB法）
• 2.3 转基因植株的PCR阳性检测
• 1代筛选'>2.4 转基因植株的T₁代筛选
• 2.5 T-DNA侧翼序列的分离
• 2.6 侧翼序列的共分离检测
• 2代筛选'>2.7 转基因植株的T₂代筛选
• 3. 结果
• 1代筛选'>3.1 转基因植株的T₁代筛选
• 3.2 转基因植株的 PCR阳性检测
• 3.3 T-DNA侧翼序列分离
• 3.3.1 T-DNA侧翼序列的分离
• 3.3.2 T-DNA侧翼序列的验证及利用
• 2代筛选'>3.4 转基因植株的T₂代筛选
• 4. 讨论
• 4.1 突变体的田间筛选
• 4.2 T-DNA侧翼序列的分离
• 第三章 SDP1基因的功能分析
• 1. 材料
• 1.1 植物材料和细菌菌株
• 1.2 质粒载体
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要设备
• 2. 方法
• 2.1 DNA的抽提和 Southern杂交
• 2.2 RNA的抽提与反转录
• 2.3 SDP1基因的计算机分析
• 2.4 SDP1基因的功能分析
• 3代遗传稳定性分析'>2.4.1 T₃代遗传稳定性分析
• 2.4.2 拷贝数检测
• 2.4.3 互补载体后代表型观察及基因型检测
• 2.4.4 GUS基因在植株中的表达
• 2.4.5 RT-PCR表达分析
• 2.4.6 pSDP1::GFP融合表达载体构建及转化
• 2.5 生理功能分析
• 2.5.1 激素敏感性实验
• 2.5.1.1 激素大田处理材料
• 2.5.1.2 GA室内处理材料
• 2.5.1.3 暗室处理材料
• 2.5.2 色素含量的测定
• 2.6 农艺性状分析
• 2.6.1 不同时期株高的测定
• 2.6.2 考种
• 3. 结果
• 3.1 SDP1基因的计算机分析
• 3.2 SDP1基因的功能分析
• 3代遗传稳定性分析'>3.2.1 T₃代遗传稳定性分析
• 3.2.2 Southern杂交检测拷贝数
• 3.2.3 互补载体后代表型观察及验证
• 3.2.4 GUS基因在植株中的表达
• 3.2.5 RT-PCR表达分析
• 3.2.6 pSDP1::GFP融合表达载体的验证及转化
• 3.3 生理功能分析
• 3.3.1 激素敏感性实验
• 3.3.1.1 激素处理大田材料
• 3.3.1.2 GA室内处理材料
• 3.3.1.3 暗室处理材料
• 3.3.2 色素含量的测定
• 3.4 农艺性状考查
• 3.4.1 不同时期株高的测定
• 3.4.2 考种
• 4. 讨论
• 4.1 互补载体的构建
• 4.2 基因的表达分析
• 4.3 基因的功能分析
• 4.3.1 突变可能与控制株高的基因有关
• 4.3.2 突变可能与控制叶色的基因有关
• 4.3.3 突变可能与控制抽穗期基因有关
• 4.3.4 SDP1基因功能探讨小结
• 5. 进一步研究设想
• 参考文献
• 致谢
• 附录