Bacillus Macorous WSH02-06发酵法生产γ-环糊精葡萄糖基转移酶的研究

论文题目: Bacillus Macorous WSH02-06发酵法生产γ-环糊精葡萄糖基转移酶的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 发酵工程

作者: 王峰

导师: 陈坚

关键词: 发酵条件优化,金属离子,溶解氧,比生长速率,比合成速率,流加发酵,表面活性物质

文献来源: 江南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase,简称CGTase或CGT酶, EC 2.4.1.19）属于α-淀粉酶家族,能够催化淀粉及相关基质进行分子间转糖基反应合成环糊精。环糊精是一种由不同葡萄糖单元组成的具有环状结构的低聚糖。环糊精作为分子胶囊,已被广泛应用于分析化学、农业、制药、食品及化妆品等领域。环糊精主要分成α、β、γ型。目前为止,见诸于报道的和商业化的绝大部分CGT酶是α和β-CGT酶。虽然γ-环糊精拥有比α、β-环糊精更大的非极性空腔和更高的水溶性,能够与活性大分子形成高活性浓度的包结配合物,但迄今为止,所知道的能够产γ-CGT酶的微生物还是不多,相关发酵产酶的系统研究报道也比较少。本论文以实验室保藏的一株能高产γ-CGT酶的芽孢杆菌（B. macorous WSH 02-06）为生产菌株,以高的酶产量和高的酶生产强度为目标,系统研究了该菌株生产γ-CGT酶动力学特性。主要研究内容如下:1.通过单因素扫描的摇瓶实验,确定了玉米淀粉是B. macorous WSH02-06生产γ-CGT酶的最佳碳源。产酶的最佳氮源是蛋白胨、玉米浆和硫酸铵。金属离子镁、锰、锌的组合添加在促进产酶和细胞生长方面的效果显著。正交优化实验结果表明,影响产酶的各种营养因素的主从因子顺序为玉米淀粉>硫酸锰>蛋白胨>硫酸锌。产酶的最适初始pH值为7.0,最佳的温度为37℃,合适的接种量为10 %,适合的摇瓶装液量为500 ml摇瓶装80 ml的培养基。发酵条件优化后得到的酶产量比优化前的酶产量提高了八倍左右,达到375.3 U·ml-1。摇瓶补料的实验结果表明,采用在发酵6小时补加氮源和发酵12小时补加碳源的这种补料方式有利于菌体生长和产酶。2.在摇瓶发酵中,考察了镁、锰、锌等金属离子的不同组合添加对γ-CGT酶发酵的影响。研究结果表明,在发酵培养基中同时添加镁离子(4.88 mmol·L-1)、锰离子(2.96mmol·L-1)和锌离子(0.174 mmol·L-1)时,获得的γ-CGT酶产量最大,达392.5 U·ml-1,细胞干重也最大,为5.2 g·L-1,其中酶产量比不添加金属离子的对照组提高了三倍。这时获得的细胞量也为最大,达到5.2 g·L-1。3.镁、锰、锌的添加促进了胞内能量物质ATP的合成。胞内的ATP/ADP由不添加金属离子进行发酵时的1.86,提高到镁、锰、锌组合添加进行发酵时的2.72,由此增加了细胞内的能量储备,有利于菌体生长和酶的合成。细胞量和酶产量的增加与镁离子的消耗量呈线性关系,但锰、锌离子的促进作用也不可忽视。

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 环糊精及其应用

1.1.1 环糊精的结构、组成及其功能

1.1.1.1 环糊精的生产方法

1.2 淀粉降解酶

1.2.1 淀粉降解酶

1.2.1.1 淀粉降解酶的分类

1.2.1.2 淀粉酶家族氨基酸序列及三维结构比较

1.2.2 环糊精葡萄糖基转移酶

1.3 环糊精葡萄糖基转移酶的生产

1.3.1 发酵过程优化和控制

1.3.1.1 营养和培养条件优化

1.3.1.2 不同的发酵生产方式

1.3.2 CGT 酶基因过量表达与合成调节

1.4 本文研究的主要内容

1.4.1 CGT 酶生产中存在的问题

1.4.2 本文的主要研究内容

参考文献

第二章 B. macorous WSH02-06 生产γ-CGT 酶的摇瓶发酵研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 碳源对γ-CGT 酶发酵生产的影响

2.3.2 氮源对γ-CGT 酶发酵生产的影响

2.3.3 磷酸氢二钾和磷酸二氢钠对γ-CGT 酶发酵生产的影响

2.3.4 金属离子的选择

2.3.5 正交试验设计优化γ-CGT 酶发酵所需的营养因素

2.3.6 营养组分对B. macorous WSH02-06 合成不同CGT 酶比例的影响

2.3.7 接种量对γ-CGT 酶发酵生产的影响

2.3.8 环境条件对B. macorous WSH02-06 发酵生产γ-CGT 酶的影响

2.3.9 B.macorous WSH02-06 生产γ-CGT 酶的摇瓶发酵过程

2.3.10 γ-CGT 酶发酵的摇瓶补料实验

2.4 本章小结

参考文献

第三章 金属离子对γ-CGT 酶生产的促进和细胞能量代谢的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.3.1 镁、锰、锌的添加对γ-CGT 酶合成的影响

3.3.2 镁、锰、锌的不同添加方式对细胞生长影响

3.3.3 发酵过程中镁、锰、锌离子消耗的情况

3.3.4 镁、锰、锌添加对发酵过程中总糖消耗的影响

3.3.5 不同金属离子添加方式对胞内ATP 和ADP 含量的影响

3.4 讨论

3.5 本章小结

参考文献

第四章 搅拌转速、相对溶氧对γ-CGT 酶发酵的影响

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 不同搅拌转速对γ-CGT 酶发酵的影响

4.3.2 不同DO 水平对γ-CGT 酶发酵的影响

4.3.3 两阶段供氧控制策略对γ-CGT 酶发酵的影响

4.4 本章小结

参考文献

第五章 细胞生长与γ-CGT 酶生产的关系

5.1 引言

5.1.1 分解代谢物阻遏机制

5.1.2 流加发酵

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 发酵过程中玉米淀粉的降解情况与分解代谢物的形成

5.3.2 直链麦芽低聚糖(LM)对产酶的分解代谢物阻遏效应

5.3.3 γ-CGT 酶发酵过程中菌体生长与酶合成之间的关系

5.3.3.1 搅拌转速对菌体生长、LM 积累和γ-CGT 酶合成的影响

5.3.3.2 控制恒定pH 对菌体生长、LM 积累和γ-CGT 酶合成的影响

5.3.3.3 温度对菌体生长、LM 积累和γ-CGT 酶合成的影响

5.3.4 指数流加发酵

5.3.5 遗传算法优化底物流加轨迹进行流加发酵

5.3.5.1 B. macorous WSH02-06 细胞生长过程数学模拟

5.3.5.2 遗传算法优化底物流加速率进行流加发酵

5.3.6 不同培养方式下γ-CGT 酶发酵生产的比较

5.4 本章小结

参考文献

第六章 表面活性物质对B. macorous WSH02-06 生产γ-CGT 酶的促进

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 B. macorous WSH 02-06 摇瓶发酵生产γ-CGT 酶过程

6.3.2 表面活性剂和短链伯醇的添加对细胞生长的影响

6.3.3 表面活性剂和短链伯醇的添加对γ-CGT 酶生产的影响

6.3.4 正丙醇和Tween-60 的添加对细胞膜脂脂肪酸组成的影响

6.3.5 5 L 罐中正丙醇的不同添加方式对γ-CGT 酶发酵的影响

6.4 本章小结

参考文献

结论

论文创新点

攻读博士学位期间论文发表和写作情况

致谢

附录 英文缩写与中文名称对照

发布时间: 2006-07-20

参考文献

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