cFLIP在头颈部鳞状细胞癌中的表达及其在Luteolin诱导Hep-2细胞凋亡中的作用

论文摘要

第一部分:cFLIP在头颈部鳞状细胞癌中的表达以及其临床意义目的Fas（Apo-1,CD95）信号通路在诱导肿瘤细胞凋亡、维持机体免疫监视功能中发挥着重要作用。虽然头颈部鳞状细胞癌（Head and neck squamous cellcarcinoma,HNSCC）细胞均不同程度地表达Fas蛋白,但是,体内、外实验证实头颈部鳞状细胞癌细胞对Fas受体介导的细胞凋亡并不敏感,这意味着在头颈部鳞状细胞癌细胞中可能存在着可以抑制Fas受体介导的细胞凋亡的因子。cFLIP（细胞型FLICE样抑制蛋白cellular FLICE-like inhibitory protein,cFLIP）是近年来发现的一类新型凋亡调控蛋白,它可以抑制Fas及其它死亡受体介导的细胞凋亡,并且其表达水平与多种肿瘤的发生、发展存在一定的相关性。而关于cFLIP在头颈部鳞状细胞癌中表达的研究尚未见报道。因此,本实验的目的旨于明确cFLIP在头颈部鳞状细胞癌中的表达情况,并探讨其表达与肿瘤临床病理参数、Fas蛋白表达情况的相关性。方法运用免疫组织化学染色方法检测了58例头颈部鳞状细胞癌组织及30例形态学正常的、肿瘤周围粘膜组织中cFLIP、Fas蛋白表达情况;运用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术检测了30例癌组织及正常粘膜组织中cFLIP两种蛋白亚型的mRNA表达水平;另外,应用Western blot方法进一步明确了cFLIP两种蛋白亚型在头颈部鳞状细胞癌组织及正常粘膜组织中的表达情况。结果1.cFLIP在头颈部鳞状细胞癌组织中的表达明显高于在正常粘膜:肿瘤组织中的阳性表达率为94.8%（55/58）,然而仅有15.0%（3/20）的正常粘膜呈现出轻微的cFLIP阳性反应,并且两者染色积分间的差异具有显著性（P＜0.01）。2.虽然在mRNA水平,cFLIP的两种蛋白亚型:cFLIPLmRNA、cFLIPsmRNA在头颈部鳞状细胞癌组织中均有表达,并且两者的表达水平均高于其在正常粘膜中的表达（P＜0.01）,但是利用Western blot方法仅检测到cFLIPL蛋白的表达。3.由于cFLIPL mRNA和cFLIP蛋白表达水平之间存在明显的相关性、Western blot方法仅检测到cFLIPL蛋白的表达,因此,可以认为cFLIPL是cFLIP蛋白在头颈部鳞状细胞癌中的主要表达亚型。4.cFLIP蛋白的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤原发部位和组织学分级之间无相关性,但是与肿瘤TNM分期（P＜0.01）以及有无淋巴结转移密切相关（P=0.01）。5.虽然,所有的正常粘膜组织和89.7%（52/58）肿瘤组织均不同程度的表达Fas蛋白,但是,Fas蛋白染色积分在两组间的差异无统计学意义。并且,Fas蛋自在肿瘤组织中的表达与患者的年龄、性别、肿瘤原发部位、组织学分级、TNM分期以及淋巴结转移情况等临床病理学参数均无相关性。虽然,所有Fas蛋白阳性表达的肿瘤组织均不同程度的表达cFLIP蛋白,但是,两者的染色积分无任何相关性（P＞0.05）。结论cFLIPL蛋白高表达在头颈部鳞状细胞癌中是常见现象,并且cFLIPL蛋白的表达情况与肿瘤TNM分期以及有无淋巴结转移密切相关。由此可见,高表达的cFLIPL蛋白可以通过抑制Fas或其它的死亡受体介导的细胞凋亡从而在头颈部鳞状细胞癌的发生、发展过程中发挥着重要作用。第二部分:Luteolin诱导Hep-2细胞凋亡的途径以及cFLIP的作用目的木犀草素（Luteolin）是一种很具有代表性的天然黄酮化合物,具有多种生物学功能。近年来,其抗癌活性引起人们的关注。Luteolin可以抑制多种肿瘤细胞的增殖或诱导细胞凋亡,但是,关于其对头颈部鳞状细胞癌（Head andneck squamous cell carcinoma,HNSCC）细胞的作用尚未见报道,并且其抗癌机制也有待于进一步研究。虽然有研究表明Luteolin可以通过增加Caspase-8的活性、上调死亡受体表达而诱导细胞凋亡,但是,未见有关死亡受体信号通路阻断剂cFLIP在Luteolin诱导细胞凋亡中作用的研究报道。本课题第一部分的实验结果表明cFLIPL在头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织中呈现高表达,并且与肿瘤的临床分期及淋巴结转移情况密切相关。并且,有研究表明:可能正是由于缺少了Caspase-8的活化而造成Hep-2细胞系对顺铂等化疗药物的不敏感。因此,我们拟研究Luteolin是否可以抑制头颈部鳞状细胞癌细胞系——Hep-2细胞的增殖活性、诱导细胞凋亡及可能途径以及cFLIP的作用。方法Luteolin作用于Hep-2细胞不同时间阶段后用MTT法测定Luteolin对Hep-2细胞增殖活性的抑制作用;利用流式细胞仪检测Luteolin对Hep-2细胞的细胞周期的影响;以形态学、细胞凋亡标记物检测确定Luteolin是否可以诱导Hep-2细胞凋亡;利用流式细胞仪检测Caspase家族活性变化;利用Western blot方法从蛋白水平研究Luteolin对Hep-2细胞cFLIP、Fas表达的影响;应用RT-PCR技术从分子水平探讨Luteolin对Hep-2细胞cFLIP、Fas蛋白表达影响的机制,并探讨cFLIP在Luteolin诱导细胞凋亡中的可能作用。结果1.Luteolin能有效抑制体外培养的Hep-2细胞的增殖活性,并且具有浓度和时间依赖性,药物作用24h的半数抑制浓度（IC50）为52.69μmol/L。2.Luteolin不仅可以诱导Hep-2细胞发生细胞周期阻滞,细胞主要被阻滞于G1期;并且,这种细胞周期阻滞效应存在剂量依赖性。3.Annexin-V/PI双染法的结果表明Luteolin可以诱导Hep-2细胞发生凋亡,并且随作用时间延长、细胞凋亡率增加。而DAPI染色法的结果进一步从形态学上证实Luteolin不仅可以诱导Hep-2细胞发生凋亡,而且细胞凋亡率随药物浓度增大而增加。4.在Luteolin诱导Hep-2细胞发生凋亡的过程中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9均被激活,三者的活性均随着作用时间延长而增加,但是,药物作用12小时后以Caspase-8的活性增加最为突出并占居主导地位。5.Luteolin可以降低Hep-2细胞内cFLIPL蛋白的表达,并且与Caspases活化、Annexin-V/PI双染法检测到细胞凋亡的时间相吻合。随着Luteolin作用时间延长cFLIP蛋白和mRNA的表达水平均下降,而Fas蛋白及其mRNA的表达水平均升高。结论Luteolin作为一种很具有代表性的天然黄酮化合物,不仅可以抑制体外培养的Hep-2细胞的增殖活性、引起细胞周期阻滞,并可诱导Hep-2细胞发生凋亡;Caspase-8和Caspase-9引导的信号通路均参与了Luteolin诱导的Hep-2细胞凋亡;而Luteolin可以通过降低cFLIP的mRNA和蛋白表达、上调Fas的mRNA和蛋白表达,从而活化Fas介导的信号通路在这一凋亡过程中发挥着重要作用。总之,Luteolin作为一种新型抗癌药物有望用于包括头颈部鳞状细胞癌在内的多种肿瘤的治疗。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分: cFLIP在头颈部鳞状细胞癌中的表达以及其临床意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 附表
• 参考文献
• 第二部分: Luteolin诱导Hep-2细胞凋亡的途径以及cFLIP的作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 附表
• 参考文献
• 致谢
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