烤烟陈化的生理生化机制与叶面优势微生物的分离筛选及增香效应

论文摘要

本文以河南烤烟为试材,采用化学和生化技术与手段对不同陈化时期烟叶中的几种酶的酶活性变化规律和化学成分进行了分析研究;利用平板分离技术和PCR-DGGE技术相结合的方法对不同陈化时期烟叶表面的微生物多样性进行了分析,并对烟叶表面优势微生物进行了鉴定;采用荧光定量PCR技术对不同陈化阶段烟叶表面优势菌株的DNA拷贝数进行了定量检测,同时利用复合诱变剂对烟叶表面优势菌株进行诱变育种研究;通过对不同培养基组成、生长温度和环境pH值等因子研究了高效增香菌株的最佳培养条件;利用菌酶混配造型技术研制的微生物发酵增香剂研究了烤烟发酵的增香效应和增香机制,揭示了微生物发酵的主要增香机理。主要研究结果如下:1、系统研究了陈化期间不同基因型烤烟烟叶中主要化学成分和酶活性的动态变化规律。结果表明,随着陈化时间的延长,不同品种烤烟烟叶中总糖、还原糖、淀粉、总氮、可溶性蛋白质和烟碱、色素类物质和总酚类物质含量均表现为缓慢下降态势,但是,烟草品种不同,各种化学成分的变化趋势明显不同。同时,在不同陈化阶段,烟叶中多酚氧化酶、过氧化物酶、淀粉酶、蛋白酶酶活性的变化规律基本一致,表现为在烟叶陈化初期,4种酶的酶活性呈现逐渐增加的趋势,到陈化6个月或者9个月时酶活性达到最大值,之后酶活性逐渐降低。不同品种之间,陈化烟叶中4种酶活性的变化规律是一致的,表明陈化过程中酶活性变化与烟草基因型关系不大。2、对陈化烤烟烟叶表面微生物区系变化进行了研究,并对烤烟叶面优势微生物菌种进行了分离鉴定。结果表明,无论是自然陈化还是人工发酵,烤烟叶面都存在着细菌、放线菌和霉菌,没有酵母菌,其中细菌的数量最多,是发酵过程中烟叶表面优势微生物;霉菌所占比例较小,放线菌数量更少。细菌中芽孢杆菌属为优势菌群,霉菌中曲霉属和青霉属为优势菌群,放线菌主要是链霉菌属。而且,在发酵过程中叶面微生物的种类和数量都处于下降趋势,其生物活性也随之降低。首次采用PCR-DGGE技术对不同陈化阶段烟叶表面微生物的多样性进行了研究。结果表明,在不同陈化时期,相同品种烟叶表面微生物的数量和种类都存在一定差异,随着陈化时间的延长,烟叶表面部分细菌微生物数量呈现增多的趋势,部分细菌微生物呈减少态势,从总量来看,细菌微生物数量随着陈化时间的延长其数量是逐渐降低的,同一品种烟叶在不同陈化时期拥有较多共有的优势条带;不同品种间条带的差异程度较大,但不同品种烟叶表面也存在较多的共有优势菌群,经过测序分析,在不同陈化时期不同品种烟叶表面上共有的优势菌种分别为Bacteriovorax sp. EPC3、Bacillus megaterium、Uncultured Sphingomonas sp、Uncultured bacterium、Uncultured yard-trimming-compost bacterium clone S-12。同时采用平板分离方法对烟叶表面的可培养菌种进行了分离鉴定,结果表明,在烟叶表面存在的都是芽孢杆菌,他们分别是巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌。3、首次对烤烟叶面优势菌株进行了诱变选育与遗传增效研究。结果显示,以从烟叶表面筛选得到的巨大芽孢杆菌（Bacillus megatherium）BCK为出发菌株,经理化因子诱变处理,采用透明圈法进行初筛,即在淀粉培养基和蛋白培养基平板上挑取Hc值（透明圈直径与菌株直径之比）都比较大的菌株,然后对这些菌株进行摇瓶复筛,测发酵液α-淀粉酶和蛋白酶的活性,选育得到酶活性较高的高效增香菌株B8。研究表明,其产生的α-淀粉酶活性是对照（BCK）的1.905倍,蛋白酶活性是BCK的2.227倍。并且该菌株能稳定遗传,经五代传代培养后,其产生的α-淀粉酶活性是出发菌株的1.908倍;蛋白酶活性是出发菌株的1.926倍。4、率先对陈化烤烟叶面优势高效增香菌株的DNA拷贝数进行了荧光定量检测。结果表明,随着陈化时间的延长,巨大芽孢杆菌的DNA拷贝数呈先升高后降低的趋势,在陈化6个月时的每克烟叶表面所含有的巨大芽孢杆菌的DNA拷贝数最多;4种酶的活性也呈先升高后降低的趋势,在陈化6个月时酶活性达到最大值;化学成分含量呈下降趋势。巨大芽孢杆菌的DNA拷贝数的变化影响烟叶中酶活性及化学成分含量的变化,表明巨大芽孢杆菌是烟叶自然陈化的内在动力。5、对烤烟叶面优势增香菌株的最佳培养条件进行了筛选研究。结果表明,增质菌株在温度为40℃时,其菌体生长量最大;在pH值为8.0时,其增殖量最大,在偏酸碱性的条件下则不利于菌体的生长繁殖;增质菌生长的最佳碳源为玉米粉,最佳氮源为酵母浸膏;对增质菌生长最佳的金属离子为Mg2+。6、系统研究和探讨了微生物发酵增香菌种及其制剂的增香效应与增香机理。结果表明,利用优势增香菌株和高生物活性物质配制而成的烟草发酵增香剂,可以加速烟叶的发酵进程,缩短烟叶发酵周期。而且,经发酵增香剂处理后的烟叶香吃味质量明显得到改善。但是增香剂的配方组成不同,其对烟叶发酵的作用效果也就不同,表现为Ⅳ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ,其中Ⅰ号为单菌种,其它三种为复合菌种。这一结果显示,由多个增香菌种组成的烟草发酵增香剂对烟叶发酵的作用大于由单菌种配制成的增香剂。本研究结果还表明,经微生物发酵增香剂处理后的卷烟中大多数致香物质成分的含量增加,只有少部分致香成分含量降低。其中表现良好香型的物质含量增幅最大,如:苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、茄酮、β-大马酮、巨豆三烯酮的三种异构体、茄酮、（1S,2E,4R,6E,8R,11S,12E）-8,11-氧撑-2,6,12-西柏三烯-4-醇等。说明微生物发酵增香剂对提高卷烟致香成分含量的作用是十分明显的。本试验通过在烟叶表面添加优势微生物及其制剂对发酵烟叶处理后进一步证实,增香菌株可以诱发一系列与香气物质变化有关的生化反应,并通过微生物及其分泌的酶与烟叶自身酶的协同作用,使香气成分含量在较短时间内得到较大幅度的提高,从而达到改善烟叶香吃味品质的目的。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 烟叶陈化过程中生物化学变化及其对品质影响研究
• 1.1.1 陈化过程中酶活性变化及其对烟叶发酵质量的影响
• 1.1.2 烟叶陈化过程中主要化学成分的动态变化
• 1.1.3 烟叶陈化过程中致香物质的动态变化
• 1.2 微生物对陈化烟叶质量的改进及其作用效果研究
• 1.2.1 陈化烟叶表面微生物的区系研究
• 1.2.2 微生物增进发酵烟叶香吃味质量的效果研究
• 1.2.3 烟草微生物发酵对香气质量的影响研究
• 1.3 生物制剂在改善烟叶发酵质量中的作用与应用技术研究
• 1.3.1 微生物制剂在改善烟叶品质中的作用及应用技术研究
• 1.3.2 酶制剂在改善烟叶品质中的作用与应用技术研究
• 1.4 问题及展望
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 陈化过程中烤烟烟叶中化学成分和酶活性测定试验
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 取样方法
• 3.1.3 测定项目和方法
• 3.1.3.1 常规化学成分测定方法
• 3.1.3.2 酶活性测定方法
• 3.1.3.3 同工酶酶谱分析
• 3.2 不同陈化时期烤烟烟叶表面细菌微生物多样性鉴定试验
• 3.2.1 不同陈化时期烟叶表面细菌微生物总 DNA 的提取
• 3.2.2 细菌总 DNA 粗提物的纯化
• 3.2.3 细菌基因组 DNA 的 PCR 扩增
• 3.2.3.1 16SrDNA 基因 V3 区扩增
• 3.2.3.2 PCR 反应体系
• 3.2.3.3 PCR 反应条件
• 3.2.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
• 3.2.5 DGGE 条带分离测序
• 3.3 烤烟叶面微生物的分离鉴定与优势增香菌株的筛选试验
• 3.3.1 烤烟叶面微生物的分离鉴定
• 3.3.1.1 烟叶样品及其处理
• 3.3.1.2 培养基
• 3.3.1.3 分离方法
• 3.3.1.4 鉴定方法
• 3.3.2 烤烟叶面优势增香菌株的分离筛选
• 3.3.2.1 菌株
• 3.3.2.2 平板初筛
• 3.3.2.3 摇瓶复筛
• 3.3.2.4 微生物拮抗作用试验
• 3.3.3 增香菌株的鉴定
• 3.3.3.1 供试菌株
• 3.3.3.2 个体形态观察
• 3.3.3.3 群体菌落形态和培养特征的观察
• 3.3.3.4 生理生化试验
• 3.4 不同陈化时期烟叶表面优势增香菌株的定量检测试验
• 3.4.1 标准品引物设计
• 3.4.2 巨大芽孢杆菌荧光定量 PCR 特异引物设计
• 3.4.3 标准品制备
• 3.4.4 标准品的克隆测序
• 3.4.5 标准曲线绘制及菌体拷贝数的定量
• 3.5 烟叶表面优势菌株的诱变育种试验
• 3.5.1 试验材料
• 3.5.1.1 出发菌株
• 3.5.1.2 培养基
• 3.5.1.3 诱变剂
• 3.5.2 试验方法
• 3.5.2.1 诱变方法
• 3.5.2.2 初筛
• 3.5.2.3 摇瓶复筛
• 3.5.2.4 遗传稳定性试验
• 3.6 增香菌种培养条件试验
• 3.6.1 供试菌种
• 3.6.2 试验材料
• 3.6.3 试验设计
• 3.6.3.1 不同温度对菌体生长的影响
• 3.6.3.2 不同 pH 值对菌体生长的影响
• 3.6.3.3 不同碳源对菌体生长的影响
• 3.6.3.4 不同氮源对菌体生长的影响
• 3.6.3.5 不同金属离子对菌体生长的影响
• 3.7 烟草发酵增香剂处理对烤烟陈化与人工发酵增质试验
• 3.8 烟草发酵增香剂处理对卷烟增香效应试验
• 3.8.1 试验材料
• 3.8.2 增香剂的添加方法
• 3.8.3 烟叶化学成分分析
• 3.8.4 烟叶致香物质成分分析
• 3.8.5 烟叶内在质量评吸
• 4 结果与分析
• 4.1 烤烟陈化过程中烟叶化学成分和生理生化动态变化研究
• 4.1.1 陈化期间烤烟烟叶中主要化学成分的动态变化
• 4.1.1.1 陈化期间烤烟烟叶中总糖的动态变化
• 4.1.1.2 陈化期间烤烟烟叶中总氮的动态变化
• 4.1.1.3 陈化期间烤烟烟叶中还原糖的动态变化
• 4.1.1.4 陈化期间烤烟烟叶中烟碱的动态变化
• 4.1.1.5 陈化期间烤烟烟叶中可溶性蛋白质的动态变化
• 4.1.1.6 陈化期间烤烟烟叶中淀粉的动态变化
• 4.1.1.7 陈化期间烤烟烟叶中色素类物质的动态变化
• 4.1.1.8 陈化期间烤烟烟叶中总酚类物质的动态变化
• 4.1.2 烤烟陈化过程中烟叶主要酶活性的动态变化
• 4.1.2.1 陈化期间烤烟烟叶中淀粉酶活性的动态变化
• 4.1.2.2 陈化期间烤烟烟叶中蛋白酶活性的动态变化
• 4.1.2.3 陈化期间烤烟烟叶中多酚氧化酶的动态变化
• 4.1.2.4 陈化期间烤烟烟叶中过氧化物酶的动态变化
• 4.2 烤烟陈化与发酵过程中叶面微生物区系与多样性的变化
• 4.2.1 陈化过程中烤烟叶面微生物区系的变化
• 4.2.1.1 陈化期间叶面微生物数量变化
• 4.2.1.2 陈化期间叶面微生物种类的变化
• 4.2.2 人工发酵过程中烤烟叶面微生物区系变化
• 4.2.2.1 人工发酵过程中烤烟叶面微生物数量的变化
• 4.2.2.2 人工发酵过程中烤烟叶面微生物种类的变化
• 4.2.3 陈化烤烟叶面微生物多样性的检测分析
• 4.2.3.1 烟叶表面细菌基因组总 DNA 检测结果
• 4.2.3.2 PCR 扩增产物的电泳分析
• 4.2.3.3 变性梯度凝胶（DGGE）电泳分析
• 4.3 烤烟陈化过程中优势增香菌株的分离筛选与优化研究
• 4.3.1 烤烟陈化过程中优势增香菌株的分离筛选与分类鉴定
• 4.3.1.1 叶面细菌微生物平板初筛鉴定
• 4.3.1.2 叶面细菌微生物摇瓶复筛鉴定
• 4.3.1.3 烤烟叶面细菌微生物拮抗作用鉴定
• 4.3.1.4 烟叶发酵增香菌株的分类鉴定
• 4.3.2 烟草发酵优势增香菌株诱变选育与遗传稳定性研究
• 4.3.2.1 诱变剂剂量选择
• 4.3.2.2 高效增香菌种的筛选鉴定
• 4.3.2.3 高效增香菌株的遗传稳定性
• 4.3.3 陈化期间烟叶表面优势高效增香菌株筛选定位研究
• 4.3.3.1 烟叶表面微生物总 DNA 的提取
• 4.3.3.2 标准品制备及标准曲线
• 4.3.3.3 熔解曲线分析
• 4.3.3.4 烤烟叶面高效增香菌种 DNA 拷贝数的定量检测
• 4.3.4 烟草发酵增香菌种的最适培养条件研究
• 4.3.4.1 不同温度对菌株生长的影响
• 4.3.4.2 不同pH 值对菌体生长的影响
• 4.3.4.3 不同碳源对菌体生长的影响
• 4.3.4.4 不同氮源对菌体生长的影响
• 4.3.4.5 不同金属离子对菌体生长的影响
• 4.4 增香菌种及其制剂对发酵烤烟增香效应与增香机理研究
• 4.4.1 烟草发酵增香剂对发酵烤烟化学成分和烟气特性的影响
• 4.4.2 烟草发酵增香剂对配方卷烟中氨基酸和高级脂肪酸含量的影响
• 4.4.2.1 微生物发酵增香剂对卷烟中氨基酸含量的影响
• 4.4.2.2 微生物发酵增香剂对卷烟中高级脂肪酸含量的影响
• 4.4.3 微生物发酵增香剂对卷烟中致香物质和化学成分含量的影响
• 4.4.3.1 微生物发酵增香剂对卷烟致香成分含量的影响
• 4.4.3.2 微生物发酵增香剂对卷烟化学成分和内在质量的影响
• 5 结论与讨论
• 5.1 烤烟陈化过程中主要化学成分和酶活性的动态变化与作用机制
• 5.2 烤烟陈化与发酵过程中叶面微生物区系及多样性变化
• 5.3 烟叶表面优势高效增香菌株的诱变选育与荧光定位
• 5.4 烟草发酵优势增香菌株最适培养条件的优化
• 5.5 优势增香菌种及其生物制剂的增香效应
• 5.6 烟草发酵增香菌种的主要增香机理
• 6 创新点
• 参考文献
• Abstract
• 读博期间发表的相关文章（部分）