山茱萸提取物对A375细胞与Hacat细胞共培养体系黑素合成及相关基因表达的影响

论文摘要

中医认为黄褐斑为气滞血瘀、肝肾不足、脾胃虚弱等致面生色斑。山茱萸可以疏肝、补肾,是临床上内服和外用两种治法治疗黄褐斑组方中的常用药物。但是,山茱萸治疗黄褐斑的作用机理尚未被阐明,其治疗作用没有得到充分发挥。为了探寻山茱萸提取物治疗黄褐斑的作用机理,使其作用效果能够充分发挥,我们建立了人黑素瘤细胞（A375）与人角质形成细胞（Hacat）共培养模型,用此模型作为评价手段,对山茱萸提取物的药效与作用机理进行研究。通过MTT法测定细胞增殖率,研究提取物对细胞是否有促增殖及毒性作用；NaOH裂解法检测黑素含量,研究提取物是否具有抑制黑素合成的作用；多巴氧化法检测酪氨酸酶（tyrosinase, TYR）活性,研究提取物是否通过抑制黑素合成的关键酶——TYR来抑制黑素的合成；半定量RT-PCR法测定TYR、酪氨酸酶相关蛋白-1（tyrosinaserelated protein-1, TRP-1）和酪氨酸酶相关蛋白-2 （tyrosinaserelated protein-2, TRP-2） mRNA表达,研究提取物是否通过调节这几种关键酶的mRNA表达量来影响黑素的合成。结果,山茱萸提取物作用于A375细胞与Hacat细胞共培养模型后,除山茱萸提取物生药浓度为12g·L-1时对细胞有明显毒性,导致细胞大量死亡外,6g·L-1、3g·L-1、1.5g·L-1、0.75g·L-1四个浓度组对细胞增殖率无显著影响；其中6g·L-1、3g·L-1浓度组对黑素合成有极显著抑制作用（P<0.01）,作用效果优于阳性对照药物熊果苷,1.5g·L-1、0.75g·L-1浓度组对黑素合成也有显著抑制作用（P<0.05）,作用效果与熊果苷组无显著差异；6g·L-1、3g·L-1、1.5g·L-1、0.75g·L-1四个浓度组对TYR活性均有极显著抑制作用（P<0.01）,作用效果与熊果苷类似；6g·L-1浓度组能够使黑素细胞TYR、TRP-1和TRP-2 mRNA表达量分别比阴性对照组下调36.07%、62.34%、44.69%,3g·L-1浓度组能够使黑素细胞TYR、TRP-1和TRP-2 mRNA表达量分别比阴性对照组下调24.1%、53.0%、16.11%。可见,山茱萸提取物能够抑制TYR活性和下调TYR、TRP-1和TRP-2 mRNA的表达量,从而抑制正常人黑素细胞中黑素合成。本研究初步阐明了山茱萸治疗黄褐斑的作用效果及作用机理,为中药祛斑新药及功效型化妆品的开发奠定了基础。

论文目录

• 目录
• 英文缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 山茱萸的研究现状
• 1.1 山茱萸的化学成分
• 1.2 山茱萸的药理作用
• 2 黄褐斑的研究现状
• 2.1 黄褐斑的成因
• 2.2 黄褐斑的形成与黑素合成的关系
• 2.3 黄褐斑的治疗
• 2.4 黄褐斑治疗研究的发展
• 3 细胞共培养技术在治疗黄褐斑药物研究领域的应用及前景
• 3.1 细胞共培养的方法
• 3.2 细胞共培养技术在祛斑中药筛选领域的应用及发展
• 3.3 小结
• 第二章 人黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型的建立
• 引言
• 1 实验仪器与材料
• 1.1 细胞
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 试剂与药液的配制
• 2.2 黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养模型的建立
• 2.3 实验分组
• 2.4 黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型指标测定
• 2.5 统计分析
• 3 结果
• 3.1 黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养
• 3.2 熊果苷对共培养模型细胞增殖率的影响
• 3.3 熊果苷对共培养模型TYR活性的影响
• 3.4 熊果苷对共培养模型黑素含量的影响
• 4 小结
• 第三章 山茱萸提取物对黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型TYR活性和黑素合成的影响
• 引言
• 1 实验仪器与材料
• 1.1 药材
• 1.2 仪器
• 1.3 试剂
• 2 实验方法
• 2.1 试剂与药液的配制
• 2.2 实验分组
• 2.3 黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型指标测定
• 2.4 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 山茱萸提取物对共培养模型细胞增殖活性的影响
• 3.2 山茱萸水提取物对共培养模型黑素含量的影响
• 3.3 山茱萸提取物对共培养模型TYR活性的影响
• 4 小结
• 第四章 山茱萸提取物对共培养模型中TYR及其相关蛋白mRNA表达的影响
• 引言
• 1 实验仪器与材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 试剂与药液的配制
• 2.2 实验分组
• 2.3 细胞总RNA的提取
• 2.4 总RNA的纯度测定
• 2.5 引物设计
• 2.6 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 2.7 PCR扩增
• 2.8 PCR扩增产物电泳鉴定
• 2.9 统计处理
• 3 结果
• 3.1 山茱萸提取物对TYR基因mRNA表达的影响
• 3.2 山茱萸提取物对TRP-1mRNA表达的影响
• 3.3 山茱萸提取物对TRP-2mRNA表达的影响
• 第五章 综合结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 个人简历