完全甜柿及部分雄性种质间的亲缘关系研究

论文摘要

中国柿（Diospyros kaki Thunb．）在长期栽培过程中，由于遗传变异和自然、人工选择的作用，分化出了许多宝贵的甜柿资源。本研究对部分柿属雄性种质及甜柿种质采用RAPD、ISSR等分子标记分析，结合对新发现原产中国大别山区雄性种质花粉基础生物学研究，建立和优化柿属植物ITS-PCR及AFLP技术体系，对部分柿属雄性种质间亲缘关系、系统演化及遗传多样性进行了分析比较，探讨柿属雄性种质在中国原产甜柿起源演化中可能的作用。主要结果如下： 1．12份供试雄性种质花粉萌芽率在20.1％—38.5％之间；除台湾正柿及油柿外，其余试材的花粉均能在罗田甜柿的柱头上萌发；雄株2号、雄株3号、雄株8号不含巨大花粉，其余试材有0.18％—4.44％不同比例的巨大花粉存在。 2．对29份柿属雄性种质RAPD分析结果如下：从118条随机引物中筛选得到32条引物，共扩增得到499条谱带，平均多态性比率87.17％，26个种质特异性标记，平均多态性信息含量为0.6097。3种方法（UPGMA法，ME法，Wagner简约法）聚类分析表明：中国柿种质与日本柿种质明显聚为2个类群，甜柿与涩柿不能截然分开；完全雄性资源同罗田甜柿亲缘关系密切；湘西甜柿和日本甜柿关系密切，宝盖甜柿和磨盘柿（罗田）亲缘关系密切；3种聚类方法结果基本聚类分组结果类似，同时也存在极少数差异；主成分分析和主坐标分析支持聚类分析结果。 3．建立了适合柿属植物的ISSR分析技术体系：25μL反应体系中，含1×Buffer，Mg2+2.0或2.5mmol／L，dNTPs 0.2mmol／L，引物0.6μmol／L，Taq DNA聚合酶1U，甲酰胺2％，模板DNA 2.4ng／μL；PCR扩增程序：94℃变性3min；94℃ 30s，（Tm+2）℃（根据引物不同设定）45s，72℃ 1.5min，35个循环；72℃延伸7min；2％琼脂糖电泳分离PCR产物。对52份柿属雄性种质ISSR分析结果如下：从58条ISSR引物中筛选得到20条随机引物，共扩增得到274条谱带，平均多态性比率92.33％，30个种质特异性标记，平均多态性信息含量为0.7119。3种方法聚类分析结果表明中国柿种质、日本柿种质可以分成不同的3-5组，甜柿与涩柿虽不能截然分开，但甜、涩柿种质基本可以分为不同的组，仅有2个完全甜柿种质分在涩柿1组中；3个韩国涩柿品种和中国涩柿品种亲缘关系密切，分组结果和地理起源较为一致；完全雄性种质和罗田甜柿亲缘关系密切，宝盖甜柿

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摘要

Abstract

缩略词表

第一章课题的提出和前人研究进展

1 课题的提出

2 前人研究进展

2.1 用于系统学及分类学研究的形态标记和细胞学标记

2.1.1 形态标记

2.1.2 细胞学标记

2.2 用于系统学和遗传多样性研究的分子方法

2.2.1 蛋白质标记

2.2.2 DNA分子标记

2.2.2.1 RFLP分析

2.2.2.2 RAPD分析

2.2.2.3 SSR分析

2.2.2.4 ISSR分析

2.2.2.5 AFLP分析

2.2.2.6 序列分析

2.2.2.7 反转录转座子

2.3 柿属植物系统分类研究进展

2.4 植物性别分化及柿属植物开花习性

2.4.1 植物的性别及进化途径

2.4.2 果树性别分化类型与柿属植物性别分化类型

3 研究目的和内容

3.1 研究目的

3.2 研究内容

第二章部分柿属植物基本花粉生物学特性研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 花粉离体萌发率测定

2.2.2 巨大花粉比例测定

2.2.3 花粉活体萌发观察

3 结果与分析

3.1 柿属雄性种质花粉离体萌发率测定

3.2 柿属雄性种质花粉活体萌发观察

3.3 柿属雄性种质花粉直径大小及巨大花粉比率

4 讨论

4.1 柿完全雄性资源与遗传育种

4.2 柿完全雄性资源2n花粉潜在育种学价值

第三章柿属雄性种质亲缘关系的RAPD分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 主要试剂及仪器

2.2.2 基因组总DNA的提取与质量检测

2.2.3 RAPD-PCR分析

2.2.4 数据处理及分析方法

2.2.4.1 计算有关遗传参数

2.2.4.2 聚类分析

2.2.4.3 主坐标分析

3 结果与分析

3.1 柿属植物RAPD反应体系优化

3.2 RAPD扩增产物的多态性分析

3.3 基于RAPD标记的聚类分析

3.3.1 29份柿种质基于UPGMA法的聚类分析

3.3.2 29份柿种质基于ME法的聚类分析

3.3.3 29份柿种质基于Wagner简约法的聚类分析

3.4 RAPD标记的主坐标分析

4 讨论

4.1 RAPD用于系统学研究的可靠性

4.2 RAPD标记同柿属植物研究中分子标记多态性比较

4.3 RAPD聚类结果同柿属植物其它分子系统学研究比较

4.4 雄花性状和甜涩性状与系统分类

第四章柿属雄性种质亲缘关系ISSR分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 主要试剂及仪器

2.2.2 基因组总DNA的提取与质量检测

2.2.3 ISSR-PCR反应体系优化

3 结果与分析

3.1 ISSR技术体系建立

2+浓度对ISSR反应的影响'>3.1.1 Mg²⁺浓度对ISSR反应的影响

3.1.2 dNTPs浓度对ISSR反应的影响

3.1.3 Taq DNA聚合酶浓度对ISSR反应的影响

3.1.4 引物浓度对ISSR反应的影响

3.1.5 退火温度对ISSR反应的影响

3.1.6 模板DNA浓度对ISSR反应的影响

3.1.7 扩增循环数对ISSR反应的影响

3.1.8 柿属植物ISSR指纹图谱构建

3.2 52份柿种质ISSR分析

3.2.1 ISSR扩增产物的多态性分析

3.2.2 基于ISSR标记的聚类分析

3.2.2.1 52份柿种质基于UPGMA法的聚类分析

3.2.2.2 52份柿种质基于ME法的聚类分析

3.2.2.3 52份柿种质基于Wagner简约法的聚类分析

3.2.3 ISSR标记的主坐标分析

4 讨论

4.1 ISSR-PCR扩增反应需注意的问题

4.2 引物及其退火温度与ISSR反应稳定性

4.3 ISSR标记多态性同柿属植物其它分子标记研究比较

4.4 雄花性状与柿属植物系统分类

4.5 ISSR聚类分析结果同柿属植物其它分子系统学研究比较

4.6 外类群与柿属植物系统分类

第五章 RAPD数据与ISSR数据整合分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 主要试剂及仪器

2.2.2 基因组总DNA的提取与质量检测

2.2.3 RAPD分析及ISSR分析

2.2.4 数据处理及分析方法

2.2.5 RAPD标记和ISSR标记的比较和整合应用

3 结果与分析

3.1 RAPD标记和ISSR标记相关性分析

3.2 综合RAPD标记和ISSR标记对28份柿种质的聚类分析

3.3 RAPD标记和ISSR标记比较分析

4 讨论

4.1 RAPD标记与ISSR标记多态性水平

4.2 RAPD标记与ISSR标记结果相关性

第六章柿属植物ITS-PCR技术与AFLP技术建立

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 ITS-PCR反应体系优化

2.2.2 AFLP反应体系优化

3 结果与分析

3.1 柿属植物ITS序列PCR扩增条件优化

3.1.1 退火温度对柿属植物ITS序列PCR扩增的影响

3.1.2 引物组合对柿属植物ITS序列PCR扩增的影响

3.1.3 添加剂对柿属植物ITS序列PCR扩增的影响

3.1.4 变性温度对老鸦柿ITS序列PCR扩增的影响

3.1.5 PCR仪对5份柿属植物ITS序列PCR扩增的影响

3.1.6 柿属植物ITS-PCR技术体系

3.2 柿属植物AFLP技术体系建立

3.2.1 双酶切对扩增结果的影响

3.2.2 连接产物稀释倍数

2+浓度对预扩增和选择性扩增的影响'>3.2.3 Mg²⁺浓度对预扩增和选择性扩增的影响

4 讨论

4.1 DNA质量、引物及测序手段对柿属植物ITS分析的影响

4.2 柿属植物AFLP反应体系建立需要注意的问题

第七章总讨论

1 柿属植物及完全甜柿起源演化途径

2 雄性资源在甜柿起源演化途径中的作用

3 进一步开展中国甜柿起源演化研究思路

4 不同聚类方法对聚类分析结果的影响

5 不同分子标记手段对分子系统学研究的影响

参考文献

附录

致谢

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