基因枪介导玉米pepc基因转入小麦的研究

论文摘要

本研究选取在黄淮麦区具有一定生产应用价值的16份小麦品种（系），通过比较不同基因型幼穗和幼胚愈伤组织诱导、增殖及分化的差异，筛选出组培特性较好，综合性状优良的转基因受体基因型；构建含有gus基因和bar基因的高光效表达载体；研究幼胚愈伤组织对潮霉素和L-PPT（草丁膦）的敏感性，确定了合适的选择浓度；研究基因枪转化小麦幼胚的影响因素并对获得的抗性植株进行了检测。本研究获得了如下结果：1．小麦遗传转化受体基因型的筛选1．1幼穗培养筛选结果将供试的16个小麦材料的幼穗接种到诱导培养基上，不同基因型出愈时间没有明显差异。不同基因型衍生的愈伤组织质量差异较为明显。不同基因型的幼穗愈伤组织诱导率存在显著差异。增殖率率在四次继代过程中存在显著差异，K35幼穗愈伤组织增殖率在四次继代过程中一直保持最高；周19、01H186-20-24、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5、郑麦9023愈伤组织生长较快，增殖率在四次继代过程中均较高。幼穗愈伤组织在分化培养基上进行分化时，不同基因型愈伤组织绿点分化率和绿苗分化率在四次继代过程中存在显著差异。继代培养过程中，16个基因型的分化频率均有一定程度的下降，但各基因型之间下降的幅度不同，从而在分化能力的保持方面表现出一定的差异。周19、2000H863-13-4-4、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5、K35幼穗愈伤组织绿点分化率在1-4次继代过程中均较高；周19、2000H863-13-4-4、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5幼穗愈伤组织绿苗分化率在1-4次继代过程中均较高。1．2幼胚培养筛选结果将供试的16个小麦材料的幼胚接种到诱导培养基上，不同基因型出愈时间存在差异。不同基因型衍生的愈伤组织质量差异较为明显。各基因型幼胚出愈率没有差异。经过四次继代后各基因型幼胚愈伤组织增殖率存在明显差异，观35、周19、01H186-20-24、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5其愈伤组织生长较快，增殖率在四次继代过程中均较高。幼胚愈伤组织在分化培养基上进行分化时，周19、01H186-20-24、2000H863-13-4-4、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5、K35幼胚愈伤组织绿点分化率在1-4次继代过程中均较高；周19、2000H863-13-4-4、2000H1012-2-1-5幼胚愈伤组织绿苗分化率在1-4次继代过程中均较高，且丛生苗较多，生长健壮。综合幼穗、幼胚试验结果，周19和2000H1012-2-1-5的组织培养特性较好，可作为小麦离体培养和转基因受体材料的优良基因型。16个基因型的幼穗和幼胚在四次继代的过程中，出愈率和增殖率并无显著差异，但幼胚愈伤组织分化绿苗率明显高于幼穗愈伤组织分化绿苗率，且幼穗取材数量受限制，因此我们认为幼胚比幼穗更适合作为小麦组织培养和遗传转化的外植体。2．高光效表达载体的构建将来自C4作物（玉米）光合作用中的高光效基因pepc基因插入到植物表达质粒pPPC中，获得了携带gus基因和bar基因的植物表达载体pPC46。经酶切和PCR检测，证明载体构建成功。3．小麦幼胚愈伤组织对潮霉素和L-PPT敏感性试验周19和2000H1012-2-1-5对潮霉素浓度敏感性不同。周19对潮霉素的耐受性比2000H1012-2-1-5强。潮霉素110mg/L是周19小麦幼胚愈伤组织比较理想的筛选浓度。潮霉素80 mg/L是2000H1012-2-1-5小麦幼胚愈伤组织比较理想的筛选浓度。周19和2000H1012-2-1-5幼胚愈伤组织接入附加不同浓度L-PPT的继代培养基，各处理之间幼胚愈伤组织的生长没有明显差异。转入附加L-PPT的分化培养基中，同一基因型各处理之间幼胚愈伤组织在分化阶段对L-PPT的敏感性差异明显，L-PPT6mg/L是周19和2000H1012-2-1-5幼胚愈伤组织比较理想的分化筛选浓度。4．基因枪转化小麦幼胚影响因素研究以gus基因的瞬时表达和愈伤组织的绿芽分化率作为评价基因枪轰击效果的衡量指标，对影响基因枪转化效率的轰击参数：轰击压力、轰击距离、金粉用量、轰击次数等进行了研究。结合GUS染色结果和愈伤组织的绿芽率，基因枪转化2000H1012--2-1-5合适的轰击压力是900psi，轰击距离是9cm，金粉用量是250μg/枪，轰击次数是1次。5．抗性植株的检测采用pPC46表达载体和经优化的基因枪轰击参数进行基因枪转化2000H1012-2-1-5幼胚的试验，愈伤组织分化出了绿色的芽苗，挑选已分化出根和芽的幼胚愈伤组织和分化出的叶芽进行GUS染色检测，初步证明己经将带有目的基因的表达载体转入到小麦中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物光合作用的机制及提高作物产量的设想
• 1.2 植物高光效基因及转基因应用
• 1.2.1 Rubisco—核酮糖—1,5—二磷酸羧化酶/加氧酶
• 1.2.2 PEPCase—磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
• 1.2.3 PPDK—磷酸丙酮酸二激酶
• 1.2.4 NADP-ME（NADP-malic enzyme）—依赖于NAD（P）的苹果酸酶
• 1.2.5 磷酸蔗糖合成酶
• 1.3 高光效基因转化存在的问题
• 1.4 小麦转基因的主要方法和研究进展
• 1.4.1 基因枪法
• 1.4.2 农杆菌介导法
• 1.4.3 花粉管通道法
• 1.4.4 PEG介导基因转化法
• 1.4.5 脂质体介导基因转化法
• 1.4.6 电击介导基因转化法
• 1.5 研究目的意义及内容
• 1.6 研究技术路线
• 1.6.1 2006年试验技术路线
• 1.6.2 2007年试验技术路线
• 第二章 小麦遗传转化受体基因型的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物供试材料
• 2.1.2 外植体接种和培养
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 数据统计
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同基因型小麦幼穗愈伤组织诱导与分化结果
• 2.2.2 不同基因型小麦幼胚愈伤组织诱导与分化结果
• 2.3 讨论
• 第三章 小麦高光效表达载体的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 质粒及试剂
• 3.1.2 限制性内切酶酶切反应
• 3.1.3 DNA片段的回收与纯化
• 3.1.4 DNA片段的连接反应
• 3.1.5 重组质粒的筛选与鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 表达载体的构建
• 3.2.2 重组质粒的鉴定
• 3.3 讨论
• 第四章 小麦愈伤组织对潮霉素和L-PPT敏感性试验
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试材料
• 4.1.2 外植体接种和培养
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 小麦愈伤组织对潮霉素的敏感性试验
• 4.1.5 小麦愈伤组织对L-PPT的敏感性试验
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 潮霉素对小麦幼胚愈伤组织诱导和生长的影响
• 4.2.2 L-PPT对小麦愈伤组织诱导和分化的影响
• 4.3 讨论
• 第五章 基因枪转化小麦幼胚影响因素的研究
• 5.1 材料与方法:
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 外植体接种和培养
• 5.1.3 质粒提取及纯化
• 5.1.4 轰击前后愈伤组织的处理
• 5.1.5 轰击参数
• 5.1.6 金粉悬液的制备
• 5.1.7 微弹制备
• 5.1.8 基因枪的装备
• 5.1.9 基因枪的轰击
• 5.1.10 GUS基因组织化学染色法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 金粉用量的影响
• 5.2.2 基因枪轰击距离的影响
• 5.2.3 基因枪轰击压力的影响
• 5.2.4 基因枪轰击次数的影响
• 5.3 讨论
• 第六章 玉米pepc基因转化小麦的试验进展
• 6.1 2006年基因枪介导玉米pepc基因转化小麦的试验
• 6.1.1 材料与方法
• 6.1.2 结果与分析
• 6.2 2007年基因枪介导玉米pepc基因转化小麦的试验
• 6.2.1 材料与方法
• 6.2.2 结果与分析
• 6.3 下一步试验计划
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢