论文摘要
第一部分逆分化细胞是胶质瘤发生、发展、治疗的靶细胞【目的】探讨BTSCs体外分化过程中的回逆现象,为研究其分化抑制机制奠定基础。【方法】利用CD133免疫磁珠筛选系统,从肿瘤组织中分离获得CD133+细胞（BTSCs）,分成4组进行培养:（1）含10%胎牛血清（FCS）;（2）10%FCS+VPA;（3）无FCS+生长因子;（4）无FCS+生长因子+VPA。取不同时间点上的细胞,相差显微镜观察其形态变化;流式细胞术检测与分化相关的标志物、细胞周期和DNA倍体变化;免疫激光共聚焦分析与分化相关标志物的共表达情况。【结果】无FCS条件下培养的BTSCs呈悬浮球状生长,高表达CD133和Nestin,不表达GFAP和β-TubulinⅢ,G0/G1期细胞占大多数,G2/M期细胞接近0%,DNA都是异倍体,对VPA反应不敏感。含FCS培养原本悬浮的细胞约4 h开始贴壁,均呈圆形。此后逐渐向多形性分化,至7 d时分化的细胞部分又返回至圆形,至10 d21 d时,有的还能重新恢复球形并呈悬浮生长。培养3 d、7 d、10 d和21 d时,CD133、Nestin阳性细胞数先降后升,GFAP+和β-TubulinⅢ+细胞数始终处于较低水平。含FCS培养液中加入VPA,细胞形态上未见上述的回逆现象,CD133和Nestin表达的先降后升现象消失,GFAP和β-TubulinⅢ在第7 d以后表达明显升高,但极大部分细胞共表达Nestin。而神经干细胞（NSCs）在含FCS培养至10 d时即以GFAP和β-TubulinⅢ表达为主,未见CD133+细胞。此外,含血清培养时BTSCs仍以异倍体为主,含少量的G2/M期细胞,加VPA诱导后细胞周期和DNA倍体变化不明显。【结论】BTSCs在含血清条件下培养出现的多向分化表型不稳定,时有去分化所导致的回逆。加入诱导分化剂VPA培养,虽然能阻止回逆现象出现,并有代表星形胶质细胞和神经元标志物表达上升,但因其共表达Nestin而仍属于未完全分化细胞,表明BTSCs分化始终处于受抑状态。第二部分p18INK4c基因失活参与胶质瘤的发生发展【目的】探讨p18INK4c基因在胶质瘤发生发展中的作用。【方法】分别用RT-PCR和免疫组化检测人脑胶质瘤细胞和组织中p18INK4c基因的表达变化;MS-PCR分析胶质瘤细胞中p18INK4c基因启动子甲基化状态;通过测序分析p18INK4c基因的序列变化;构建真核表达载体pcDNA-p18INK4c,脂质体Lipofectamine 2000介导转染人脑胶质瘤细胞SHG44,RT-PCR检测基因表达,流式细胞仪分析细胞增殖周期变化。【结果】8株人脑胶质瘤细胞系中5株细胞不表达p18INK4c基因,其中2株中基因启动子呈甲基化状态;3株细胞表达p18INK4c基因,基因启动子区都呈去甲基化。68例人脑胶质瘤组织中22例不表达、46例表达p18蛋白。BTSCs中p18INK4c表达缺失。转染p18INK4c基因后,SHG44细胞中出现明显p18INK4c表达,细胞周期G0/G1期细胞增加,S期细胞减少。【结论】部分胶质瘤细胞和组织中p18INK4c基因表达缺失,启动子甲基化是导致基因表达沉默的原因之一。p18INK4c基因失活参与了胶质瘤的发生发展过程。第三部分诱导分化治疗人脑胶质瘤的靶细胞与靶分子【目的】探讨丙戊酸钠诱导人脑胶质瘤细胞分化时作用的靶细胞和靶分子。【方法】丙戊酸钠治疗位于裸小鼠皮下的可移植性人脑胶质瘤,半定量RT-PCR检测移植瘤中HDAC1和Tob的表达;CD133免疫磁珠分离胶质瘤组织中的CD133+细胞,在分别含血清或不含血清加生长因子的条件下培养,加丙戊酸钠作用21d,流式细胞仪检测和共聚焦显微镜观察分化标志物表达。【结果】丙戊酸钠能明显抑制位于裸小鼠皮下移植瘤的增殖,使HDAC1表达下降,Tob表达升高。流式细胞仪检测丙戊酸钠作用21d的细胞,在含血清条件下,GFAP或β-tubulinⅢ阳性细胞数显著增加,而无血清加生长因子条件下两标志物表达均无显著差异;共聚焦显微镜观察显示上述的GFAP+或β-tubulinⅢ+细胞共表达Nestin。【结论】VPA逆转人脑胶质瘤细胞分化抑制的靶分子有HDAC1和Tob,靶细胞为处于分化过程中的脑肿瘤干细胞。第四部分ABCG2和MGMT基因启动子甲基化异常与胶质瘤细胞耐药【目的】分析胶质瘤细胞中耐药基因ABCG2和MGMT启动子甲基化与基因表达之间的关系。【方法】RT-PCR检测胶质瘤细胞中ABCG2和MGMT的表达,MS-PCR分析基因启动子甲基化状态,用去甲基化试剂5-氮-脱氧胞苷处理胶质瘤细胞U251后分析基因表达变化。【结果】8株人脑胶质瘤细胞中有6株细胞表达ABCG2,其中5株细胞中ABCG2基因呈去甲基化,1株甲基化与去甲基化共存;2株细胞不表达ABCG2,其中1株甲基化与去甲基化共存,1株没有检测出甲基化和去甲基化产物。5株细胞表达MGMT,3株细胞不表达,其中5株细胞中MGMT为去甲基化,4株为高甲基化。【结论】胶质瘤细胞中部分细胞表达ABCG2和/或MGMT,基因启动子区呈去甲基化状态,这些细胞可能对相关药物耐药;而启动子高甲基化是胶质瘤细胞中ABCG2和MGMT基因失活的重要因素。
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