玉米幼苗四个水份胁迫响应基因在不同耐旱自交系中的表达分析

论文摘要

为了深入研究玉米耐旱的分子机理,本研究用一耐旱玉米自交系“81565”,构建了水份胁迫下玉米幼苗差异表达mRNA的cDNA文库,并筛选鉴定了其中5个EST序列。其中两个是玉米的类胰蛋白丝氨酸蛋白酶基因（tryspin-like serineproteases,Dege）和不依赖辅助因子的磷酸甘油酸变位酶基因（cofactor-independent phosphoglycerate mutase,PGAM-i）,一个基因编码具有NADH脱氢酶活性的还原酶,两个功能未知,这里命名为E4和F4。类胰蛋白丝氨酸蛋白酶（DegP）广泛参与生物耐热激反应和高等植物中的光抑制修复反应。拟南芥物种的AtDegP1,AtDegP5,AtDegP8和AtDegP2蛋白通过降解氧化变性的D1蛋白,而恢复PSⅡ的光合作用。耐盐植物冰草（Mesembryanthemu crystallinum）中,磷酸甘油酸变位酶基因（PGAM-i）的表达响应多种非生物逆境胁迫。基因E4的编码蛋白是含有DUF6和TPT结构域的膜整合蛋白。为了研究DegP,PGAM-i,E4和F4这4个基因如何响应水份胁迫,本实验用实时定量PCR技术对4个基因在水份胁迫下（20%PEG处理）的6个玉米自交系中的表达进行了分析。6个玉米自交系“81565”,“87-1”,“丹340”,“R09”,“200B”,“ES40”具有不同的田间耐旱性。DegP基因在植物的抗热激和PSⅡ光合抑制修复中起到重要作用,为近一步研究此基因在玉米耐旱中的作用和对产量的影响,克隆了玉米的DegP基因,并作了初步的生物信息学分析。主要的研究结果如下:1.用耐旱自交系“81565”和抑制差减杂交,反式Northern技术分离鉴定了玉米幼苗水份胁迫条件下上调表达的5个EST序列,其中三个分别是编码DegP,PGAM-i,NADH还原酶的基因,两个功能未知。2.自交系“81565”中Dege,PGAM-i,E4和F4基因的表达响应水份胁迫。正常生长条件下,DegP,PGAM-i,E4和F4基因都有一定量的表达。在PEG处理的6h时,水份胁迫抑制了4个基因的表达,它们的表达量都低于胁迫处理前的表达量。随着胁迫处理时间的延长,4基因的表达量开始上升。在胁迫12 h时,PGAM-i基因的相对表达量达到了处理前的1.4倍。在胁迫24 h时,DegP基因的相对表达量是处理前的0.6倍;E4基因是处理前的1.2倍,F4基因是处理前的1.6倍。水份胁迫处理下,PGAM-i,E4和F4基因的表达都上调了。3.水份胁迫下,6玉米自交系中4基因的表达模式有相似和不同。耐旱自交系“87-1”和“R09”4基因的表达模式和“81565”自交系的相似。耐旱自交系“200B”中DegP基因的表达受到抑制,水份胁迫24 h时,PGAM-i基因的表达量被诱导到处理前的6倍,E4被诱导到2.6倍,F4基因被诱导到2倍。不耐旱自交系“丹340”中DegP和E4基因被下调表达,PGAM-i基因的表达在胁迫24 h时得到恢复,F4基因受胁迫诱导上调表达。不耐旱自交系“ES40”4基因的表达都受水份胁迫抑制,表达量一直降低。这从分子水平也反映出“ES40”自交系的弱耐旱性。4.克隆了玉米自交系“87-1”中的DegP基因,发现其存在缺失突变,并分析了DegP基因此位点的序列多样性。生物信息学分析发现玉米基因DegP和拟南芥的AtDegP8基因同源性非常高,二者间氨基酸序列的相似性是66%。分析同时发现玉米基因组中存在一个和AtDegP1基因同源性较高的DegP家族的另一成员,二者N端氨基酸序列比较,其一致性是53%。本文的研究结果表明,玉米中DegP,PGAM-i,E4,F4基因的表达响应水份胁迫,它们的表达对增加玉米的耐旱性有着重要作用。6个自交系间的比较分析显示了它们在干旱胁迫下对4个基因的不同调控模式。其中三个耐旱自交系“81565”,“R09”,“87-1”对4个基因的上调表达显示了其在水分胁迫时,它们更迅速的调控能力。自交系“ES40”在水份胁迫下4个基因的表达一直受到抑制,这和它的弱耐旱性一致。高等植物的DegP基因家族广泛参与了植物的耐热激反应和光抑制修复反应。由于玉米DegP基因和AtDegP8基因的蛋白序列相似性很高,推测玉米的此基因为AtDegP8的同源基因。拟南芥的AtDegP1,AtDegP5,AtDegP8蛋白位于叶绿体内囊体内腔中,它们和位于内囊体基质的AtDegP2蛋白,及FtsH蛋白一起修复光抑制反应,恢复光合反应正常进行。这些结果显示DegP基因家族对提高玉米物种的耐旱性有重要作用,它们对逆境胁迫下的产量也有重要影响。玉米DegP基因存在不同基因型,如自交系“87-1”中的缺失突变型,推测其不能合成有功能的完整DegP蛋白。这种基因型和自交系耐旱能力的关系,有待近一步研究。

论文目录

• 缩写词及中英文对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 植物耐旱的生理生化反应
• 1.1.1 气孔行为
• 1.1.2 光合作用调节
• 1.1.3 渗透调节
• 1.1.4 逆境胁迫蛋白
• 1.1.5 抗氧化系统的调节
• 1.1.6 多胺类物质的耐旱性
• 1.2 植物抗逆的信号转导
• 1.2.1 感受胁迫信号或激素信号的双组分系统
• 1.2.2 第二信使及激素信号
• 1.3 植物抗逆的分子水平研究
• 1.3.1 耐旱相关基因的表达调控
• 1.3.2 热激转录因子和热激蛋白
• 1.3.3 类胰蛋白丝氨酸蛋白酶与植物的抗逆性
• 1.4 抑制差减杂交技术
• 1.4.1 抑制差减杂交技术的原理和实验程序
• 1.4.2 抑制差减杂交技术的特点及在玉米基因分离上的应用
• 1.5 实时定量PCR分析基因的转录水平
• 1.6 本研究的目的意义和技术路线
• 1.6.1 目的意义
• 1.6.2 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 玉米自交系材料
• 2.2 克隆载体和转化菌株
• 2.3 玉米自交系生长条件和水份胁迫处理
• 2.4 叶片总RNA提取和mRNA纯化
• 2.5 抑制差减杂交
• 2.5.1 双链cDNA的合成
• 2.5.1.1 cDNA第一链的合成
• 2.5.1.2 cDNA第二链的合成
• 2.5.2 双链cDNA的Rsa Ⅰ酶切
• 2.5.3 接头序列连接
• 2.5.4 第一轮杂交
• 2.5.5 第二轮杂交
• 2.5.6 第一轮PCR扩增
• 2.5.7 第二轮PCR扩增
• 2.6 差减后cDNA产物的克隆
• 2.7 反式Northern杂交
• 2.7.1 反式Northern主要试剂
• 2.7.2 消减克隆斑点印迹膜制备
• 2.7.2.1 PCR扩增差减克隆中的cDNA插入片段
• 2.7.2.2 cDNA斑点印迹膜制备
• 2.7.3 地高辛标记cDNA探针
• 2.7.3.1 总RNA反转录为cDNA探针
• 2.7.3.2 探针标记
• 2.7.3.3 标记探针的定量
• 2.7.4 杂交反应
• 2.7.4.1 预杂交
• 2.7.4.2 杂交
• 2.7.5 杂交结果检测
• 2.8 序列测定分析和基因功能预测
• 2.9 实时定量PCR分析过程
• 2.10 玉米自交系"87-1"中DegP基因的克隆
• 2.10.1 "87-1"中DegP5'序列的克隆
• 2.10.2 "87-1"DegP基因3'序列和中间序列的克隆
• 3 结果与分析
• 3.1 叶片总RNA提取及浓度和纯度检测
• 3.2 构建SSH文库cDNA合成及Rsa Ⅰ酶切效率分析
• 3.3 正向差减后的cDNA
• 3.3.1 正向差减两轮PCR产物
• 3.3.2 正向差减cDNA的克隆
• 3.4 反式Northern鉴定的特异表达cDNA
• 3.4.1 标记探针的定量
• 3.4.2 鉴定的特异表达cDNA
• 3.5 测序结果及相似性分析
• 3.5.1 B1片段
• 3.5.2 A2片段
• 3.5.3 C4片段
• 3.5.4 E4片段
• 3.5.5 F4片段
• 3.6 4个基因在水份胁迫的6个自交系中的表达模式
• 3.6.1 实时定量PCR中5个基因引物的特异性
• 3.6.2 4个基因在6个玉米自交系中的表达模式
• 3.7 玉米自交系"87-1" DegP基因的序列
• 3.8 "87-1"DegP基因的生物信息学分析
• 3.8.1 "87-1"DegP基因的ORF分析
• 3.8.2 自交系"87-1"DegP基因发生碱基缺失
• 3.8.3 完整ORF的ZmDegP基因与"87-1"DegP基因的比对分析
• 3.8.4 不同物种中DegP蛋白的结构分析
• 3.8.5 玉米基因组中其它DegP基因的鉴定
• 4 讨论
• 4.1 NADH脱氢酶与玉米耐早性的关系
• 4.2 玉米DegP,PGAM-i,E4和F4基因对水份胁迫的响应
• 4.2.1 水份胁迫下4个基因的表达模式表明它们响应水份胁迫
• 4.2.2 自交系间对4个基因的转录调控有差异
• 4.3 玉米的ZmDegP基因
• 4.3.1 克隆的一个玉米DegP基因
• 4.3.2 玉米中ZmDegP基因和水份胁迫的响应
• 4.3.3 玉米基因组中存在DegP基因家族其它成员
• 4.4 玉米基因ZmDegP的突变和序列多样性
• 附录A 玉米ZmDegP基因的构建
• 附录B 实验中所用到的分子生物学方法
• 方法1 玉米叶片总RNA提取
• 方法2 RNA样品的Dnase Ⅰ处理
• 方法3 mRNA分离纯化
• 方法4 PCR产物的回收与纯化
• 2法）'>方法5 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 方法6 连接反应
• 方法7 热激转化重组载体
• 方法8 质粒DNA提取
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文