论文摘要
研究背景和目的:嗜酸粒细胞性支气管炎（eosinophilic bronchitis,EB）是慢性咳嗽的主要原因。诱导痰和气道粘膜病理检查表明,EB同样存在以嗜酸性粒细胞为主的多种炎症细胞浸润。但EB为何缺乏气道高反应性,EB是否会发展为气道高反应性或支气管哮喘（bronchial asthma）?本研究通过观察EB的临床特征及免疫病理特征,分析其与支气管哮喘患者的差异。同时,通过研究EB和哮喘支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）细胞蛋白质组双向电泳表达谱,找出表达差异蛋白,为筛选气道高反应性和气流可逆性阻塞相关的特异蛋白、探讨哮喘气道高反应性和气流可逆性的发病机制奠定基础。在此基础上,探讨建立缺乏气道高反应性的EB动物模型的可能性和途径,试图从动物实验进一步深入研究EB和哮喘的关系,为支气管哮喘的早期干预寻找新的靶点。结果及结论:1. EB和哮喘的气道炎症病理特点相似,涉及多种炎症细胞,包括嗜酸性粒细胞（eosinophil,Eos）、T淋巴细胞和肥大细胞等,但EB的气道炎症程度较哮喘轻,炎症范围更为局限。2.双向电泳图像对比分析表明,EB与哮喘之间BLAF细胞蛋白表达存在一定的差异。本研究成功鉴定了EB、哮喘之间的2个差异表达蛋白,其中谷胱甘肽-S-转移酶T1（glutathione-S-transferase T1,GSTT1）可能与气道反应性的发生机制密切相关。3.初步成功建立了具有明显的Eos气道炎症、但无气道高反应性的BALB/c小鼠EB模型,为进一步了解EB的气道炎症及气道高反应性的发生机制奠定了基础。第一部分:嗜酸粒细胞性支气管炎与支气管哮喘患者免疫病理特征的比较目的:了解EB气道的病理学特征,比较其与支气管哮喘气道炎症的异同。方法:对20例EB、24例支气管哮喘和10例正常人进行诱导痰检查,分析诱导痰的细胞分类;经支气管纤维镜支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage,BAL）,分析BALF的细胞分类;于隆突、左舌叶开口、右下叶前段取支气管粘膜活检,光镜下观察活检标本的病理结构特征,测量气道上皮粘膜的基底膜厚度,通过免疫组化技术,观察气道粘膜上皮层和上皮下层炎症细胞（Eos、肥大细胞、T淋巴细胞）的分布情况并计算其细胞分布密度。实验结果中的计量资料用中位数表示,组间比较采用非参数秩和检验。结果:1. EB组痰Eos百分率[10.13%（20.19）]显著低于哮喘组[26.00%（32.97）]（P<0.05）。EB组和哮喘组诱导痰Eos百分率均显著高于对照组[0.25%（0.50）]（P<0.001）。2. EB组BALF的Eos百分率[1.63%（3.81）]显著低于哮喘组[11.75%（15.70）]（P<0.001）,EB组和哮喘组BALF的Eos百分率均显著高于对照组[0.38%（1.00）（P<0.05）。3.哮喘组舌叶开口支气管粘膜基底膜厚度[4.73μm（2.61）]显著大于正常对照组[3.23μm（1.35）]（P<0.001）和EB组[3.41μm（1.89）]（P<0.01）,但EB组和正常对照组之间无差异（P>0.05）。哮喘组右下叶前段支气管粘膜基底膜厚度[5.36μm（3.65）]显著大于EB组[3.53μm（3.18）]（P<0.05）。)4.比较舌叶支气管粘膜上皮下层的Eos分布密度,哮喘组[8.91个/mm2 （52.88）]显著高于EB组[0.00个/mm2 （10.40）]和正常对照组[0.00个/mm2 （0.00）]（P<0.05）。5.比较舌叶支气管粘膜上皮层的淋巴细胞分布密度,EB组[475.76个/mm2（244.75）]和哮喘组[583.29个/mm2（507.69）]显著高于正常对照组[260.71个/mm2（430.31）] ,而EB和哮喘组差异无显著性（P>0.05）。6.比较舌叶支气管粘膜的肥大细胞分布密度:在粘膜上皮层,EB组[168.80个/mm（2314.28）]和哮喘组[252.78个/mm（2545.68）]显著高于正常对照组[0.00个/mm2（13.61）];在粘膜上皮下层,EB组[218.44个/mm2（383.65）]和哮喘组[197.22个/mm2（208.54）]显著高于正常对照组[66.07个/mm2（45.92）];而EB和哮喘组差异无显著性（P>0.05）。结论:EB和哮喘的气道炎症病理特点相似,涉及嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞和肥大细胞等多种炎症细胞,但EB的气道炎症程度较哮喘轻,炎症范围更为局限。第二部分:嗜酸粒细胞性支气管炎与支气管哮喘分子生物基础差异的初步探讨研究背景和目的:在前面的研究中,我们发现EB和哮喘气道炎症病理尽管有很多相似的地方,但也有明显的差异。支气管肺泡灌洗液能够比较直接和客观地反映气道炎症的变化,被认为是蛋白组学研究气道炎症性疾病的理想样本。本实验的目的是利用比较蛋白质组学方法,探讨EB与支气管哮喘差异的分子生物学基础,以筛选鉴定与气道高反应性、气流可逆性阻塞相关的特异蛋白。方法:收集EB 5例、哮喘和正常人各6例,经纤维支气管镜于右中叶行支气管肺泡灌洗取得BALF,提取BALF细胞总蛋白质后,利用固相pH梯度（immobilized pH gradient, IPG）,双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）对总蛋白进行分离,然后行硝酸银染色,予ImageMaster 2D Elite 5.0分析软件进行凝胶图像分析,寻找EB、哮喘和正常对照组差异表达的蛋白质。应用基质辅助电离解析飞行时间质谱（matrix-assitsted laser desorption / ionization time–of -flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）获得蛋白质的肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprint, PMF）,再通过MALDI-TOF/TOF-MS串级质谱对蛋白质进行序列分析,得到蛋白质二级质谱图。最后利用Mascot软件搜索NCBInr蛋白质数据库,将获得的肽段信息进行对比分析,明确是何种蛋白质。结果:双向电泳图像对比分析表明,EB、哮喘和正常对照组BLAF细胞蛋白表达有一定的差异。各蛋白斑点经质谱检测肽质量指纹谱与标准分子量、等电点对照分析鉴定出2个蛋白,分别为铁蛋白（ferritin, light polypeptide）和谷胱甘肽-S-转移酶T1（glutathione-S-transferase T1,GSTT1）,其中铁蛋白在哮喘组表达上调。EB组中GSTT1高表达,而83.3%哮喘患者和33.3正常对照不表达GSTT1。结论:1.电泳图像对比分析表明,EB与哮喘之间BLAF细胞蛋白表达存在一定的差异。2.成功鉴定了EB和哮喘之间的2个差异表达蛋白,其中GSTT1可能与气道反应性的发生机制密切相关。第三部分嗜酸粒细胞性支气管炎动物模型的建立及其与哮喘动物模型的气道炎症的比较分题1小鼠气道反应性方法的建立目的:建立过敏性小鼠气道反应性检查的正确方法。方法:采用SPF级BALB/c雌性小鼠,通过OVA致敏和激发的方法建立过敏性气道炎症模型（下称OVA组,n=36）,第0、7、14d分别给予10μg OVA+1.3mg Al（OH）3生理盐水混悬液200μl腹腔注射致敏,第28d予100ug OVA滴鼻激发。生理盐水作为正常对照（下称NS组,n=36）。根据肺功能检查方法的不同再细分为4组:无创OVA组,无创NS组,有创OVA组,有创NS组,每组18只。气道反应性检查采用Buxco公司有创肺功能检查系统（“RC”系统）及无创肺功能检查系统（“Penh”系统）。激发24小时（第29天）后,以吸入倍增浓度的乙酰甲胆碱（methacholine ,Mch）雾化液[浓度依次为0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50（mg/ml）检查小鼠的气道反应性。有创检查时,以肺阻力（lung resistance,RL）为观察指标,通过药物的剂量-反应曲线来评价动物的气道反应性。无创检查时,以Penh为观察指标,通过药物的剂量-反应曲线及Penh较基础值上升100%、200%的吸入Mch的浓度（Penh200、Penh300）来评价动物的气道反应性。检查BALF细胞学分类和上气道、肺组织病理改变。另予0.3mM,3.0mM和30mM组织胺对OVA和NS组进行鼻组胺激发试验,每次激发后,观察10分钟内小鼠的打喷嚏和擦鼻次数,通过药物的剂量-反应曲线比较两组的差异。结果:1.OVA组及NS组Penh%,RL%均有随Mch浓度升高而增加的趋势,吸入浓度为6.25、12.5、25mg/ml的Mch时,无创OVA组Penh%显著高于无创NS组（P<0.05 ）,且Penh200、Penh300显著低于无创NS组（P<0.001）。而有创OVA组气道反应性与有创NS组无显著差异（P>0.05 ）。2.OVA组BALF中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分率显著高于NS组（P<0.01）。与NS组比较,OVA组肺组织炎症改变明显（P<0.01）。而无创OVA组BALF的Eos百分比[（27.06±12.05）%]和细胞总数[（2.69±0.55）×105/ml)]与有创OVA组[（25.33±10.79）%,（2.86±0.55）×105/ml)]无显著差异,两组下呼吸道组织病理评分亦无显著差异（P>0.05 ）。3.鼻组胺激发试验显示,在30mM组织胺浓度时,OVA组擦鼻次数[（73.00±28.30）次]显著高于对照组[（43.40±34.07）次]（P<0.05 ）。OVA组上呼吸道病理检查显示上呼吸道轻度Eos炎症改变。结论:1.无创检查法较有创检查法对同一气道过敏疾病模型气道反应性的结果不相一致,其原因可能是模型气道炎症程度较轻,无创检查法受到上呼吸道阻力增加的影响所致。2.首次检查小鼠过敏性气道炎症模型气道反应性时,建议先用有创检查方法进行确定。分题2嗜酸粒细胞性气道炎症的小鼠模型的建立目的:通过调节抗原激发的时间、途径和剂量,建立无气道高反应性的BALB/c小鼠EB模型。方法:56只BALB/c雌性小鼠,分为4组:气道过敏雾化组（下称OVA-雾化组,n=8）、气道过敏1次滴鼻组（下称OVA 1次滴鼻组,n=12）、气道过敏2次滴鼻组（下称OVA 2次滴鼻组,n=8）、生理盐水对照组（下称对照组, n=28）。致敏方法同前。OVA-雾化组第28d予1%OVA雾化30分钟激发;OVA-1次滴鼻组第28天予100ug OVA滴鼻激发;OVA-2次滴鼻组第28d,第29天各予100ug OVA滴鼻激发。对照组因各模型组致敏、激发时间采用生理盐水进行致敏和激发。最后一次激发24小时后,有创检查法测定动物的气道反应性,并观察气道炎症情况。结果:1.气道反应性的测定:激发24小时后,各组RL%均有随Mch浓度升高而增加的趋势。在吸入浓度为0.39-50mg/ml的Mch时,OVA 1次滴鼻组和OVA雾化组RL%较对照组无显著性差异（P > 0.05）;在吸入浓度为25mg/ml的Mch时,OVA 2次滴鼻组RL%显著高于对照组（P < 0.05）。2.各模型组巨噬细胞百分率显著低于对照组（P<0.05）,而中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分率和淋巴细胞百分率显著高于对照组（P<0.05）。3. OVA雾化组巨噬细胞百分率显著高于OVA1次滴鼻组和OVA 2次滴鼻组（P<0.01,P<0.001）,而嗜酸性粒细胞百分率[（7.40±3.41）%]显著低于OVA 1次滴鼻组[（25.33±10.79）%]和OVA 2次滴鼻组[（39.73±6.02）%]（P<0.01,P<0.001）。结论:通过调节抗原激发的时间、途径和剂量,本实验初步成功建立了具有明显的Eos气道炎症、但无气道高反应性的BALB/c小鼠EB模型,为进一步研究EB的气道炎症及气道高反应性的发生机制奠定了基础。分题3嗜酸粒细胞性支气管炎动物模型的气道炎症及其与哮喘动物模型的比较目的:观察BALB/c小鼠EB模型的气道炎症特征并比较其与哮喘动物模型的气道炎症的差异。方法:80只BALB/c雌性小鼠,分为3组:EB模型组（下称EB组,n=28）、哮喘模型组（下称哮喘组,n=12）、生理盐水对照组（下称对照组,n=40）。致敏方法同前。EB模型组第28d予100ug OVA滴鼻激发;哮喘组第28,29,30d予100ug OVA滴鼻激发（每天1次）。对照组因每组致敏、激发时间采用生理盐水进行致敏和激发。在末次激发24小时后,各组（n=12）分别检测小鼠的下列指标:有创检查法测定气道高反应性,支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞总数及细胞分类,支气管及肺组织炎症程度。此外,在末次激发12、48小时后,分别观察EB组和对照组气道高反应性、BALF细胞分类的变化情况（每组n=8）。结果:1.气道反应性的测定:激发12小时、24小时及48小时后,EB组气道反应性与对照组均无显著差异（P>0.05 ）。而哮喘组在末次激发24小时后,在吸入浓度为12.5、25、50mg/ml的Mch时,RL%均显著高于对照组（P<0.05）。2.气道炎症:EB组滴鼻激发12小时、24小时、48小时后BALF的Eos百分比呈逐渐增加的趋势（P<0.05）。激发24小时后,EB、哮喘模型组BALF巨噬细胞百分率显著低于对照组（P<0.05）,而中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分率和淋巴细胞百分率显著高于对照组（P<0.05）。哮喘组BALF的Eos百分比[（42.15±13.35）%]和细胞总数[（7.59±1.33）×105/ml)]明显高于EB组[（25.33±10.79）%,（2.86±0.55）×105/ml)] （P<0.05）,而中性粒细胞百分比[（11.14±6.61）%]显著低于EB组[（23.89±23.67）%]（P<0.05）。激发24小时后,哮喘组支气管肺部炎症组织病理评分显著高于EB组（P<0.05）。结论:1.随着激发后时间的增加,EB模型的Eos气道炎症有逐步加重趋势,但并未观察到气道反应性的变化。2.本研究建立的EB模型的气道炎症程度轻于哮喘模型组。
论文目录
相关论文文献
标签：嗜酸粒细胞性支气管炎论文; 支气管哮喘论文; 气道炎症论文; 双向凝胶电泳论文; 过敏性疾病论文; 小鼠论文; 气道高反应性论文; 动物模型论文;