导读:本文包含了糖酰胺酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:酶法合成,N-糖酰胺酶PNGase,H~+,最小糖结构,底物
糖酰胺酶论文文献综述
胡孝春,王婷,蔡志鹏,刘丽,JOSEF,Voglmeir[1]（2019）在《N-糖酰胺酶PNGase H~+最小糖结构作用底物的研究》一文中研究指出为探究N-糖酰胺酶的最小糖结构作用底物,以丹磺酰氯标记的复杂型七糖糖肽标准品为初始底物,运用酶法合成的方法来获得目标底物,分别使用β-N-乙酰氨基己糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶和β-半乳糖基转移酶,制备出五种不同糖结构的糖肽底物,将制备的目标底物应用于N-糖酰胺酶PNGase H~+最小糖结构作用底物的研究中。通过高效液相色谱检测PNGase H~+对这5种糖肽底物的酶解效果。结果表明,得到五种不同结构的糖肽底物,Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man3)-Arg、Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man)-Arg、Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg、Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg及Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg,浓度分别为8.3、7.0、6.5、4.5、6.5 pmol/μL。N-糖酰胺酶PNGase H~+能够作用糖单元数为二、叁和五的糖肽底物,而对含有单个N-乙酰葡糖胺的糖肽几乎没有作用,进而推断PNGase H~+的最小糖结构作用底物为带有N-乙酰壳二糖的糖肽。(本文来源于《食品工业科技》期刊2019年11期）
王媛,贾鹏,李学俊,李玉红,陈鹏[2]（2018）在《水稻N-糖酰胺酶基因(OsPNGase A)的克隆及在毕赤酵母中的分泌表达》一文中研究指出N-聚糖酶是一类广泛应用于糖蛋白的N-糖基化修饰研究中的去糖基化酶。本研究通过RT-PCR从水稻中克隆了一个高GC含量(69.48%)的N-聚糖酶基因(Os PNGase A,XM_015775832),通过无缝克隆技术构建酵母分泌型表达载体p PICZ(α)A-Os PNGase A,在毕赤酵母SMD1168H中进行诱导表达,发酵液经DEAE Sepharose阴离子交换层析和His Trap HP金属离子螯合层析纯化,产量可达到12.3 mg/L,比活力为258 U/mg。SDS-PAGE结果显示,纯化的Os PNGase A为单一条带且与预期分子量一致。Os PNGase A能作用于水稻中重组表达的人转铁蛋白(TRF)、玉米中重组表达的鸡蛋抗生物素蛋白(Avidin)以及辣根过氧化物酶(HRP),并且对Avidin的酶切效果优于商业化的PNGase F。Os PNGase A反应的最适p H和温度分别为p H 6.0和40℃,在中性和碱性以及含有100 mmol/L还原剂β-ME和DTT的条件下仍具有活性。水稻Os PNGase A的成功表达为植物糖蛋白的研究提供一个新的工具酶,酵母分泌表达体系的建立为PNGase A的大量制备奠定了基础。(本文来源于《生物工程学报》期刊2018年03期）
Josef,Voglmeir,Yamin,Du,Ting,Wang,Xiaoqing,Gu,Li,Liu[3]（2015）在《基于新型N-糖酰胺酶PNGaseH~+的糖蛋白N-链寡糖的快捷高效检测分析方法》一文中研究指出本研究以我们挖掘到的新型N-糖酰胺酶PNGase H~+为对象,创新性地建立了一种相较于现有方法更加快捷、简单、高效的糖蛋白N-链寡糖的检测分析方法。糖组学研究是继基因组学和蛋白质组学之后的一个新的生物学研究热点,其中糖蛋白聚糖是糖组学研究的重中之重。N-糖酰胺酶(PNGase)是糖蛋白N-连接(本文来源于《2015中国酶工程与糖生物工程学术研讨会论文摘要集》期刊2015-08-21）
谷晓擎[4]（2015）在《新型N-糖酰胺酶PNGase H~+的克隆表达与特性研究》一文中研究指出糖组学研究是继基因组学和蛋白质组学之后的一个新的生物学研究热点,其中糖蛋白质聚糖是糖组学研究的重中之重。N-糖酰胺酶(PNGase)是糖蛋白N-连接糖基化研究中主要的工具酶,其作用是将糖链从所连接的蛋白质分子上释放下来进行分析,被广泛用于糖链结构信息、糖链结构与功能关系、糖链对糖蛋白功能的影响以及蛋白质结构分析等方面的研究。目前广泛使用的商业化N-糖酰胺酶主要有两种:PNGase F和PNGase A,但是这两种酶在使用中都有各自不可克服的缺点,不能完全满足糖组学飞速发展的需要。因此通过进一步的挖掘和筛选,开发出不具备自身糖基修饰、能够使用原核系统进行表达、且能最大限度酶切不同糖链结构的新N-糖酰胺酶,是糖组学研究发展的必然需求。本研究从细菌Terriglobus roseus中发现了 一种编码新型N-糖酰胺酶PNGase H~+的基因,并对该基因进行了分子克隆和体外重组表达,并对重组表达的PNGase H~+的活性及酶学特性进行了研究。具体内容如下:1.本研究从酸杆菌属Terriglobtus roseus DSM 18391中发现了一种新型的N-糖酰胺酶PNGaseH~+基因,并对其进行了基因克隆。将获得的PNGase +基因连接到pET30a载体上,然后转化至E.coli BL21(DE3)中,得到含有重组PNGaseH~+质粒的工程菌。在特定的条件下对此工程菌进行了培养及诱导表达,进而通过Ni-NTA亲和层析柱进行分离纯化,得到了纯度较高的重组PNGaes H~+酶。2.为了确定重组蛋白的活性,本研究以商业化的PNGaseF为对照,以核心结构含有α1,3-岩藻糖的糖蛋白HRP为底物,利用超高效液相进行活性初测,证明重组蛋白具有N-糖酰胺酶A样活性。以荧光标记的糖肽GNGN为底物建立了基于超高效液相的酶活性检测方法。在对重组PNGase +酶学特性进行研究的过程中,发现重组PNGase +酶的最适pH为2.6,最适反应温度为30℃,重组PNGase H~+酶无任何金属离子依赖性,而大部分常用的表面活性剂会影响其活力。3.对重组PNGaseH扩酶的底物特异性研究显示:重组PNGase +酶既可像PNGase F 一样作用于哺乳动物来源的高甘露糖型、复合型以及杂合型N-糖链,又可如PNGase A 一样作用于植物来源具有核心α1,3-岩藻糖连接的N-糖链,并克服了 PNGase A不能直接作用于糖蛋白的缺点。此外,在作用于植物来源的糖蛋白时,其对不含有核心α1,3-岩藻糖的N-糖链的酶解效率要高于PNGase F。总而言之,PNGase H~+基因的成功克隆表达弥补了现有商业化N-糖酰胺酶的缺陷,为糖生物学研究提供了功能良好、经济工具酶。(本文来源于《南京农业大学》期刊2015-04-01）
闵伟勇[5]（2014）在《N-糖酰胺酶F的表达纯化鉴定及Na~+偶联的中性氨基酸转运蛋白SNAT1的多克隆抗体制备》一文中研究指出N-糖酰胺酶F (PNGaseF)主要是由革兰氏阴性菌--脑膜炎脓杆菌分泌的一种分子量为34.8kDa的去糖基化酶。具有广泛的底物专一性，对所有类型的N-连接的糖蛋白都有作用，能从糖蛋白完整切下N-寡糖链，其作用位点是N-乙酰葡萄糖胺残基和天冬酰胺之间的价键结构，同时将蛋白质的天冬酰胺残基转化为天冬氨酸，生成的氨基寡糖链随后水解成氨气和寡糖。本研究首先通过PCR技术扩增出945bp的N-糖酰胺酶F基因，经酶切、连接，构建了大肠杆菌表达载体pET28a-PNGase F。将pET28a-PNGase F转入大肠杆菌BL21中，16°C诱导表达及Ni柱纯化后，SDS-PAGE鉴定，获得超过95%纯度的可溶性表达的N-糖酰胺酶F。对以后N-糖酰胺酶F的相关研究起到了重要的推动作用。钠离子偶联的中性氨基酸转运蛋白(Sodium-coupled Neutral Amino AcidTransporter，SNAT)属于SLC38基因家族。SLC38家族又分为System A和System N两个亚族，其中SNAT1和SNAT2属于System A，SNAT3属于SystemN，具有重要的生理功能，其功能紊乱可引起神经退行性疾病。我们通过分子克隆技术构建了PBK-CMVA-SNAT3-HA重组质粒，并通过Western blot技术证明SNAT3-HA融合蛋白正常表达，且能正常定位于细胞膜上。为了检测纯化的N-糖酰胺酶F脱糖基化功能，本文以SNAT1、SNAT2和SNAT3为底物，通过检测它们经N-糖酰胺酶F消化后在SDS-PAGE中迁移率的变化来研究N-搪酰胺酶F的脱糖基化作用。证明我们纯化的PNGase F具有高效的脱搪基化功能，同时证实了SNAT1、SNAT2和SNAT3分子中含有糖基化位点的假设。这对研究SNAT1、SNAT2和SNAT3的结构与功能提供了有效的工具。Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白SNAT1被预测具有11个跨膜区域，其N端在细胞内，C端在细胞外。本研究通过将潜在糖基化位点中的Asn突变成Gin,利用Western-blot技术通过蛋白质电泳迁移率的变化研究SNAT1中糖基化位点的数量及位置，证明了SNAT1中存在两个糖基化位点，分别为N251和N257位。为SNAT1膜拓扑结构的进一步研究起到了重要的辅助作用。目前，还没有特别适用的有效SNAT1特异性抗体，极大地阻碍了SNAT1结构与功能的深入研究。本研究通过分子克隆的方法构建了一个蛋白表达载体pET28a-SNATl-75aa,通过诱导表达纯化后，将SNAT1N端75个氨基酸作为免疫原，经过3次免疫注射新西兰大白兔获得血清，利用巯丙基琼脂糖凝胶6B亲和纯化后，获得了SNAT1特异性的抗体。为以后SNAT1结构与功能的深入研究提供了有效的工具。(本文来源于《上海师范大学》期刊2014-03-01）
闵伟勇,刘丽,张舟[6]（2013）在《N-糖酰胺酶F(PNGase F)在大肠杆菌中的表达纯化及其脱糖基化作用鉴定》一文中研究指出N-糖酰胺酶F(PNGase F)是由革兰氏阴性菌——脑膜炎脓杆菌分泌的一种分子量为34.8 kDa的去糖基化酶.本研究通过PCR技术扩增出945 bp的N-糖酰胺酶F基因,经酶切、连接,构建了大肠杆菌表达载体pET28a-PNGase F.将pET28a-PNGase F转入大肠杆菌BL21中,16℃诱导表达及Ni柱纯化后,SDS-PAGE鉴定,获得超过95%纯度的可溶性表达的N-糖酰胺酶F.对Na+依赖的中性氨基酸转运蛋白1(SNAT1)和2(SNAT2)进行脱糖基化作用检测,结果证明:纯化的N-糖酰胺酶F对SNAT1和SNAT2具有高效的脱糖基化作用.(本文来源于《上海师范大学学报(自然科学版)》期刊2013年04期）
马传亮[7]（2012）在《利用糖酰胺酶高效获得天然脱糖基化蛋白的研究》一文中研究指出糖蛋白的脱糖基化反应是对糖蛋白的鉴定和分析的重要的方法之一,很多情况下,脱糖基化过程能够很好的对目标糖蛋白进行脱糖基化。然而,大多数传统的脱糖基化过程往往会对目标蛋白造成不可逆的变性。在本实验的研究中,我们改进了一种脱糖基化方法,通过利用可以耐受高浓度的二巯基苏糖醇(DTT)的酵母重组脱糖基化酶Png1p-ΔH1,能够使目标糖蛋白获得高效的脱糖基化,并且得到的蛋白部分能够保持其天然的构象与生化活性。我们应用核糖核酸酶B(RNase B)和酵母羧肽酶Y(CPY)作为目标糖蛋白来验证本实验的过程。结果证实,他们二者都可以在高浓度DTT条件下完全脱糖基化,而且当DTT被移除时能够完美的折迭回天然结构。圆二色谱(CD)光谱分析表明,经过脱糖基化的Rnase B和CPY能够恢复他们天然的构象。实验证明利用DTT参与的Png1p-ΔH1脱糖基化方法可以有效地释放N-连接糖蛋白中的糖链,获得目标糖蛋白质的天然、有生物活性的蛋白部分。(本文来源于《江西农业大学》期刊2012-06-01）
祁庆生,王圣钧,信封学,宋蕾[8]（2008）在《粟酒裂殖酵母N-糖酰胺酶的表达及其分子鉴定和表征》一文中研究指出N-糖酰胺酶(Peptide-N~4-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl)asparigine amidase; Peptide:N-Glycanase;EC 3.5.1.52)是一类可以水解 N-连接的糖肽或糖蛋白的β-天冬胺酰葡糖胺键,释放出完整的寡糖链,并生成天冬氨酸残基的酶。在真核生物中,N-糖酰胺酶(Pnglp)(本文来源于《2008年全国糖生物学学术会议论文摘要》期刊2008-06-01）
信丰学,王鹏,钟盛华,祁庆生[9]（2008）在《粟酒裂殖酵母N-糖酰胺酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析》一文中研究指出根据GenBank中公布的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)N-糖酰胺酶(Pnglp)cDNA序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR技术从粟酒裂殖酵母中克隆出糖酰胺酶cDNA。将得到的基因克隆到表达载体pET-15b中。重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导表达和纯化提取后,进行酶活测定。实验结果表明,该酶的分子量约为39 kD,纯化后的重组N-糖酰胺酶可以对变性处理的糖蛋白进行糖链的切除,且这种作用需要还原剂DTT的辅助作用;N-糖酰胺酶只对错误折迭的糖蛋白有作用,对天然的糖蛋白没有作用。等量粟酒裂殖酵母Png1p在不同温度、pH、DTT浓度和底物变性温度下对等量核糖核酸酶B(RNase B)的脱糖基化检测发现,重组酶的最适反应温度30℃,最适反应pH为7.0,需要的最适DTT浓度为10 mmol/L,底物在100℃处理10 min时酶的脱糖基化率最高。(本文来源于《生物工程学报》期刊2008年04期）
王圣钧[10]（2007）在《酵母N-糖酰胺酶（Png1p）脱糖基化性质及其改造》一文中研究指出N-糖酰胺酶(Peptide-N~4-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl)asparigine amidase；Peptide：N-Glycanase；EC 3．5．1．52)是一类可以水解N-连接的糖肽或糖蛋白的β-天冬胺酰葡糖胺键，释放出完整的寡糖链，并生成天冬氨酸残基的酶。在真核生物中，N-糖酰胺酶(Png1p)与蛋白酶依赖的蛋白降解系统相联系，对从内质网反转运到细胞质的错误折迭的糖蛋白进行脱糖基化处理。Png1p广泛地存在于真核生物体内，主要存在于细胞质中内质网的周围。真核生物中的N-糖酰胺酶(Png1p)能够区分天然的和非天然的糖蛋白。在本论文中首先研究底物的结构同N-糖酰胺酶脱糖基化活性之间的关系。将核糖核酸酶B用两种方法不同程度变性之后，使用圆二色光谱检测其结构。同时，在体外研究大肠杆菌表达的酵母N-糖酰胺酶对核糖核酸酶B的脱糖基化活性与底物结构之间的关系。结果证实底物的结构确实能够影响N-糖酰胺酶的脱糖基化活性，并且脱糖基化的效率同底物蛋白的活性成线性关系。对于核糖核酸酶B来说，脱糖基化的临界点分别时是60-65℃和40-60mM的DTT。在体内，N-糖酰胺酶通过Rad23p与26S蛋白酶体相连接，糖蛋白的降解是被Png1p-Rad23p复合体来调节的。本研究中，在体外纯化出Png1p-Rad23p复合体并检测了各种性质。体外试验中发现，Png1p-Rad23p复合体表现出比Png1p更高的活性。同时证明，Png1p-Rad23p复合体还具有区分天然的和非天然的糖蛋白的能力。此外底物的结构能够影响Png1p-Rad23p复合体的脱糖基化效率，并且对于核糖核酸酶B脱糖基化的临界点，Png1p-Rad23p复合体是与Png1p相同的。Png1p-Rad23p复合体的脱糖基化反应的最适温度为30℃，最适pU为pH7.0，这些都与Png1p相类似。Png1p-Rad23p复合体比Png1p表现出更高的活性，并有更广的温度和pH适应性。在酵母中，Png1p的Rad23p结合区是由N-端和C-端的4个富含疏水氨基酸的α-螺旋(H1，H2，H11，H12)和N-端螺旋之前的一些伸展序列组成的。N-端螺旋H1伸展出来，与C-端的螺旋H12组成45°角，直接与Rad23p中的四个α-螺旋通过氢键、疏水作用和离子对相互连接。在本研究中，实验检测了Png1p切除N-端和C-端的4个富含疏水氨基酸的α-螺旋(H1，H2，H11，H12)之后的改造体与Png1p的活性比较。体外脱糖基化实验结果显示Png1-△(H1，H12)、Png1-△H12和Png1-△(H1，H2，H11，H12)没有活性，而Png1-△H1具有比Png1p更高的活性。同时，Png1-△H1不仅能对变性的糖蛋白脱糖基化还能作用于天然的糖蛋白。进一步实验证明底物的结构能够影响Png1-△H1的脱糖基化效率。Png1-△H1的脱糖基化反应的最适温度为30℃，最适pH为pH7.0，这些都与Png1p性质相同。经过对Png1-△H1的结构进行建模处理，分析其在水中的动力学并与Png1p在水中的动力学进行比较后发现，N-端螺旋H1切除之后，Png1p的活性中心裂隙的结合部分和两端的边缘区域柔性明显增大，这叁个区域会对底物同酶的结合产生较大的影响。(本文来源于《山东大学》期刊2007-04-02）
糖酰胺酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
N-聚糖酶是一类广泛应用于糖蛋白的N-糖基化修饰研究中的去糖基化酶。本研究通过RT-PCR从水稻中克隆了一个高GC含量(69.48%)的N-聚糖酶基因(Os PNGase A,XM_015775832),通过无缝克隆技术构建酵母分泌型表达载体p PICZ(α)A-Os PNGase A,在毕赤酵母SMD1168H中进行诱导表达,发酵液经DEAE Sepharose阴离子交换层析和His Trap HP金属离子螯合层析纯化,产量可达到12.3 mg/L,比活力为258 U/mg。SDS-PAGE结果显示,纯化的Os PNGase A为单一条带且与预期分子量一致。Os PNGase A能作用于水稻中重组表达的人转铁蛋白(TRF)、玉米中重组表达的鸡蛋抗生物素蛋白(Avidin)以及辣根过氧化物酶(HRP),并且对Avidin的酶切效果优于商业化的PNGase F。Os PNGase A反应的最适p H和温度分别为p H 6.0和40℃,在中性和碱性以及含有100 mmol/L还原剂β-ME和DTT的条件下仍具有活性。水稻Os PNGase A的成功表达为植物糖蛋白的研究提供一个新的工具酶,酵母分泌表达体系的建立为PNGase A的大量制备奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
糖酰胺酶论文参考文献
[1].胡孝春,王婷,蔡志鹏,刘丽,JOSEF,Voglmeir.N-糖酰胺酶PNGaseH~+最小糖结构作用底物的研究[J].食品工业科技.2019
[2].王媛,贾鹏,李学俊,李玉红,陈鹏.水稻N-糖酰胺酶基因(OsPNGaseA)的克隆及在毕赤酵母中的分泌表达[J].生物工程学报.2018
[3].Josef,Voglmeir,Yamin,Du,Ting,Wang,Xiaoqing,Gu,Li,Liu.基于新型N-糖酰胺酶PNGaseH~+的糖蛋白N-链寡糖的快捷高效检测分析方法[C].2015中国酶工程与糖生物工程学术研讨会论文摘要集.2015
[4].谷晓擎.新型N-糖酰胺酶PNGaseH~+的克隆表达与特性研究[D].南京农业大学.2015
[5].闵伟勇.N-糖酰胺酶F的表达纯化鉴定及Na~+偶联的中性氨基酸转运蛋白SNAT1的多克隆抗体制备[D].上海师范大学.2014
[6].闵伟勇,刘丽,张舟.N-糖酰胺酶F(PNGaseF)在大肠杆菌中的表达纯化及其脱糖基化作用鉴定[J].上海师范大学学报(自然科学版).2013
[7].马传亮.利用糖酰胺酶高效获得天然脱糖基化蛋白的研究[D].江西农业大学.2012
[8].祁庆生,王圣钧,信封学,宋蕾.粟酒裂殖酵母N-糖酰胺酶的表达及其分子鉴定和表征[C].2008年全国糖生物学学术会议论文摘要.2008
[9].信丰学,王鹏,钟盛华,祁庆生.粟酒裂殖酵母N-糖酰胺酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析[J].生物工程学报.2008
[10].王圣钧.酵母N-糖酰胺酶（Png1p）脱糖基化性质及其改造[D].山东大学.2007
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