论文摘要
慢传输性便秘（slow transit constipation, STC）是以结肠运动功能减弱为特征的一类功能性顽固性便秘,发病机制不清,保守治疗对STC效果有限,严重者最终只有手术切除全（次全）结肠。大量的临床资料表明STC多发于育龄期妇女,男女发病比例为1:9,女性STC患者往往症状更严重也更需要手术治疗。一些因素如盆腔手术,分娩,中枢神经系统疾病等可能是部分女性便秘患者的病因,但也并不能完全解释STC在女性高发病率这一现象。近来女性激素异常被认为可能是女性STC发病的关键,人们观察到妊娠对人全消化道动力有显著影响,同时便秘也是妊娠主要的并发症之一;女性月经周期中黄体期的结肠传输时间较卵泡期显著延长。进一步研究也证实慢传输型便秘患者体内过度表达孕酮受体来调节收缩性G蛋白,上调抑制性G蛋白最终导致结肠动力障碍。雌激素及其受体是否也与结肠动力障碍有关,其机制如何,迄今国内外尚未见报道。Cajal间质细胞（interstitialcells of Cajal, ICC）是肠神经系统的一种具有独立功能的特殊类型的细胞,以网状结构存在于胃肠道。目前的研究认为ICC主要有3个主要功能:胃肠道平滑肌活动的起搏;推进电活动的传播;传递并调节神经递质。一氧化氮（Nitric oxide, NO）是胃肠道的非肾上腺能非胆碱能神经引起松弛反应的主要抑制性神经递质,研究证明ICC表达一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NOS）可以产生NO并在调节NO依赖性的神经递质方面起重要的作用,其机制推测为:①神经冲动传至ICC后可促其产生NO,作用于平滑肌细胞,产生松弛效应;②ICC内NOS产生NO后,使细胞内Ca2+浓度增加,将抑制性神经信号放大;③神经末梢释放递质作用于ICC,控制NO产生,从而控制神经信号输入。雌激素介导信号快速传导的作用,可能是通过膜上的蛋白质快速激活细胞内的第二信号系统。研究发现,雌激素的刺激会引起磷脂酰肌醇激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）,促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase, MAPK）等家族蛋白激酶快速而短暂的活化,雌激素的这种快速作用有以下特点:①作用迅速而短暂,只需几秒或几分钟;②雌激素与不易透过细胞膜的高分子物质（如牛血清蛋白）偶联后,基本上不能透过细胞膜,但仍能发挥快速作用;③快速作用不被mRNA转录和蛋白质合成的抑制剂所阻断;④雌激素快速作用在缺乏雌激素受体（Estrogen receptor, ER）的细胞中仍存在。我们推测雌激素通过非基因组作用快速活化ICC内第二信号从而调控NOS活性进而影响肠道动力。这可能为女性慢传输便秘患者的病因研究提供新的见解。目的:1.检测并鉴定ICC细胞膜雌激素作用位点。2.检测雌激素通过细胞膜受体以非基因组作用快速激活细胞内信号通路。3.检测雌激素对ICC细胞NO合成和NOS活性的调控以及参与调控的相关细胞内第二信号分子。方法:本课题利用原代培养小鼠ICC,在常规光镜检查的基础上,采用免疫荧光方法对原代培养的ICC进行鉴定;进一步采用免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜技术分析ICC细胞膜雌激素结合位点;采用密度梯度离心法分离ICC细胞膜,采用同位素法、放射性配体结合分析法对mER的平衡解离常数和最大结合容量进行分析;对原代培养的ICC采用雌激素刺激,采用免疫沉淀、Western blot法检测雌激素作用后ICC内第二信号分子以及ICC内NOS的活化情况,运用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术观察雌激素快速调节ICC的NO合成情况。运用雌激素信号通路各信号分子特异性阻断剂,了解参与雌激素快速基因组作用的信号传导途径。结果:1.免疫组化结果证实体外成功分离培养小鼠肠道ICC。2.激光共聚焦观察显示,ICC细胞膜上存在雌激素作用位点,当细胞经过常规透膜及固定处理后,ICC细胞核并未发现雌激素作用位点,说明经典的雌激素受体在ICC上并无表达。3.对提取ICC细胞膜的Na+-K+-ATP酶的活性进行了检测,结果表明:提取细胞膜组分的Na+-K+-ATP酶活性为10.23±1.54μmolpi/mg/h而提取细胞浆组分的Na+-K+-ATP酶活性为0.72±0.31μmolpi/mg/h,说明提取细胞膜成功。4.放射性配体结合分析及Scathard分析证实ICC细胞膜雌激素受体的的受体最大容量（Bmax）为45.75fmol/mg protein,平衡解离常数（KD）为0.7173 nmol/L。5. Western blot实验结果显示:E2和E2BSA能够在5分钟内快速诱导ERK1/2磷酸化,磷酸化ERK1/2表达水平在E2作用ICC15分钟后达到最高,然后快速降低。雌激素受体特异性抑制剂ICI182,780可以阻断E2快速诱导ERK1/2快速磷酸化的作用6. Western blot实验结果显示:ICC表达神经型一氧化氮合酶（neuronal Nitric oxide synthase, nNOS）,E2短时间内并不能改变nNOS的表达水平。7. NOS活力检测结果显示:E2和E2BSA快速增高ICC内nNOS活性,ICC内nNOS活性在E2作用ICC15分钟后达到最高,然后快速降低。雌激素受体特异性抑制剂ICI182,780和ERK1/2特异性抑制剂UO126均可以阻断E2快速增高ICC内NOS活性的作用。8.免疫荧光观测ICC内NO合成的结果和NOS活力检测结果一致,E2和E2BSA均可以快速增加ICC内NO合成量。这种快速效应同样可以被ICI182,780和UO126阻断。结论:1.激光共聚焦观察显示,ICC细胞膜上存在雌激素作用位点,当细胞经过常规透膜及固定处理后,ICC细胞核并未发现雌激素作用位点,说明经典的核雌激素受体在ICC上并无表达。我们进一步采用放射性配体结合分析及Scathard分析了ICC细胞膜雌激素受体的的受体性质。2. Western blot实验结果显示E2和E2BSA能够快速诱导ERK1/2磷酸化,应用雌激素抑制剂ICI182,780可以阻断这一快速作用。这从功能水平证明了mER的存在。。雌激素可能通过活化ICC内ERK1/2蛋白激酶进而影响ICC的功能,发挥其生物学效应。3. NOS活力检测和NO荧光检测均证实:mER可以介导E2快速增高ICC内nNOS活性进而提高NO产量。应用ICI182,780和ERK1/2特异性抑制剂UO126均可以阻断这一作用,证明E2很有可能是通过mER活化ICC内ERK1/2信号通路,进而促进ICC内nNOS活化,最后增加ICC内NO产量。
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