论文摘要
核酸及其单核苷酸多态性(SNP)的分析检测在当前生化研究和临床诊断等领域具有重要的意义。开发简便、快速、高灵敏和特异性好的均相无标记的核酸和SNP的检测新方法具有广泛的应用前景。论文主要应用滚环扩增(RCA)和纳米粒子探针技术,结合生物发光、分子荧光和共振光散射等检测技术研究开发了系列均相无标记检测核酸和SNP的新方法,主要内容如下：1、结合简便、高效的滚环扩增反应和高灵敏的荧光虫素生物发光反应,建立了均相无标记检测SNP的新方法。方法基于突变型DNA可特异的引发滚环扩增反应,应用萤火虫素生物发光反应检测滚环扩增反应中产生的大量焦磷酸根。相对照,野生型DNA不能引发RCA反应,根据二者生物发光信号的显著差异,可实现突变型DNA的高灵敏度检测和特异地区分单碱基差别,方法对突变型DNA的定量检出限为0.45 pmol／L,可精确测定1%突变频率。2、基于滚环扩增反应的原理,在滚环扩增反应过程中,加入与滚环扩增产物互补的反向引物,该引物以滚环扩增产物为模板引发反向顶替支化扩增,产生大量的单链和双链的DNA产物,利用特异性的DNA检测荧光染料SYBR GreenI进行荧光检测,建立了滚环扩增均相无标记荧光法检测SNP的新方法。根据突变型和野生型DNA产生的荧光信号差异,实现了1%突变频率的特异性检测和高灵敏的定量检测突变型DNA,检出限为8.6 fmol／L。3、应用滚环扩增反应均相无标记检测微小RNA (miRNA)。方法以niRNA为模板使挂锁探针特异性的连接成环；然后以环形DNA探针为模板,miRNA直接作为引物引发滚环扩增反应,同时加入与RCA反应产物互补的反向引物,引发支化扩增,结果产生大量多种长度的单链和双链的DNA产物,应用特异性的DNA检测荧光染料进行定量。方法无需反转录步骤,操作简便、灵敏度高、可特异性地检测单碱基差别的miRNAs。4、制备了稳定性好、便宜和生物兼容性好的氢氧化铁纳米粒子,通过静电力作用,铁纳米粒子以DNA分子为模板进行组装聚集,应用高灵敏度共振光散射技术,分析检测聚集体的共振光散射信号,建立了铁纳米粒子均相无标记定量检测DNA的新方法。方法简单、快速、灵敏度高,对E.coli基因组DNA的检出限为1.9 ng／mL。方法为进一步研究铁纳米粒子分析检测SNP、RNA或蛋白质等生物标记物提供了基础。
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摘要Abstract第1章 引言1.1 选题背景与意义1.2 滚环扩增检测核酸和SNP的研究1.2.1 滚环扩增的原理和特点1.2.2 固相滚环扩增检测核酸和SNP1.2.3 均相滚环扩增检测核酸和SNP1.3 纳米粒子探针技术检测核酸和SNP的研究1.3.1 纳米粒子探针概述1.3.2 固相纳米粒子标记探针检测核酸和SNP1.3.3 均相纳米粒子探针检测核酸和SNP1.4 论文主要研究内容第2章 滚环扩增均相无标记生物发光检测单核苷酸多态性2.1 本章引言2.2 实验部分2.2.1 仪器与试剂2.2.2 连接反应和滚环扩增反应2.2.3 萤火虫素—萤火虫素酶反应溶液的制备2.2.4 PPi的转化和生物发光分析2.2.5 突变频率检测2.3 结果与讨论2.3.1 实验原理2.3.2 RCA反应时间和反应温度的优化2.3.3 PPi的检测2.3.4 SNP分析2.3.5 突变频率检测2.4 本章小结第3章 支化滚环扩增均相无标记荧光检测单核苷酸多态性3.1 本章引言3.2 实验部分3.2.1 仪器与试剂3.2.2 挂锁探针的连接反应和BRCA反应3.2.3 荧光检测目标DNA3.2.4 突变频率检测3.3 结果与讨论3.3.1 BRCA反应荧光检测SNP原理3.3.2 SG的用量和BRCA反应时间的影响3.3.3 SNP检测3.3.4 突变频率检测3.4 本章小结第4章 支化滚环扩增均相无标记荧光检测microRNA4.1 本章引言4.2 实验部分4.2.1 仪器与试剂4.2.2 挂锁探针的连接反应和BRCA反应4.2.3 荧光检测miRNA4.3 结果与讨论4.3.1 BRCA反应检测miRNA原理4.3.2 以miRNA为模板的DNA序列的特异性连接反应4.3.3 BRCA反应检测miRNA的特异性4.3.4 方法对miRNA检测的灵敏度4.4 本章小结第5章 铁纳米粒子共振光散射技术测定纳克级DNA5.1 本章引言5.2 实验部分5.2.1 仪器设备5.2.2 主要试剂5.2.3 实验步骤5.3 结果与讨论5.3.1 光谱特征5.3.2 实验条件优化5.3.3 其他共存物质的干扰5.3.4 校准曲线和检出限5.3.5 样品检测5.4 本章小结结论参考文献附录 在学期间发表论文情况致谢
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标签：滚环扩增论文; 纳米粒子论文; 均相无标记论文; 核酸检测论文; 单核苷酸多态性论文;
