猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112株GP3蛋白糖基化位点研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）自1987年在美国爆发以来至今已在全世界大部分地区流行。该病能引起母猪的流产,产死胎、木乃伊胎,仔猪和育肥猪有明显呼吸道症状,它的发生和流行对全世界的养猪业造成巨大打击。2006年我国爆发的以北美洲型变异的猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）为主要病原的高致病性猪蓝耳病,造成各地区不同年龄阶段的猪群出现体温高、发病率高和高死亡率的临床表现,对我国养猪业予以重创,当前如何有效的防控PRRS成为养殖者及科研人员亟待解决的问题。PRRSV中GP3蛋白与GP2a、GP4以异源三聚体的形式参与形成病毒粒子,与PRRSV的保护性免疫有关。研究表明囊膜蛋白的糖基化在病毒对宿主的受体识别、入侵、免疫逃逸及病毒毒力等方面都发挥着重要的作用。GP3是PRRSV中糖基化程度最高的囊膜蛋白,但是目前关于该蛋白糖基化对病毒的作用尚不够清楚。本研究主要是以PRRSV GP3糖基化位点为研究对象,利用软件分析高致病性猪繁殖与呼吸系统综合征弱毒疫苗株HuN4-F112的GP3氨基酸序列,发现该蛋白存在7个潜在的N-连接糖基化位点。在HuN4-F112弱毒株感染性克隆的基础上,选取N29、N42、N50、N131和N195位的糖基化位点,采用点突变的方法对其进行单点或多点组合突变使其去糖基化,构建了不同糖基化位点单点和多点突变的PRRSV全长cDNA克隆。经体外转录和转染后在MARC-145细胞成功拯救出GP3-N29Q, GP3-N42Q, GP3-N50Q, GP3-N131Q, GP3-N29/50Q, N29/195Q六株含糖基化位点突变的病毒,而N29/42,N29/131,N29/50/131,N29/42/50/131/195几种糖基化位点突变组合的全长cDNA未能拯救出病毒。分别对救获的包含突变位点的病毒进行突变位点测序分析,证实所拯救毒株的突变位点与实验设计的位点一致。利用多步法绘制拯救突变株的生长曲线,结果显示N29,N42,N50,N131位糖基化位点单点突变都不会影响子代病毒的产生,拯救的各种突变株在细胞上的复制能力均低于亲本毒HuN4-F112株,其中N50突变株的滴度低于亲本毒近106倍。对未能拯救成功的全长cDNA克隆N29/42,N29/131,N29/50/131,N29/42/50/131/195进行测序分析,发现除实验设计的相应糖基化位点改变外,其他序列均与亲本株一致。上述研究结果表明N29、N42,N50、N131位单个糖基化位点的突变会不同程度的影响PRRSV对细胞的感染能力,而多个糖基化位点同时突变消失则会影响感染性病毒粒子的形成,推测这些糖基化位点之间的协同作用可能是产生具有感染性病毒粒子所不可或缺的条件。本研究阐释了PRRSV次要结构蛋白GP3糖基化位点的作用,为后续研究糖基化对PRRS病毒粒子形成,致病性及免疫逃逸等方面的影响提供思路和依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 图表清单
• 英文缩略表
• 第一章 引言
• 1.1 PRRSV的分子生物学
• 1.1.1 病毒的分类地位
• 1.1.2 病毒的形态及理化特性
• 1.1.3 病毒的基因组结构
• 1.1.4 非结构蛋白
• 1.1.5 主要结构蛋白
• 1.1.6 次要结构蛋白
• 1.2 PRRSV的细胞嗜性与受体
• 1.2.1 硫酸乙酰肝素
• 1.2.2 唾液酸粘附素
• 1.2.3 猴波形蛋白
• 1.2.4 CD163
• 1.2.5 CD151
• 1.3 PRRSV的致病性
• 1.3.1 PRRSV对宿主的侵入
• 1.3.2 PRRSV的抗体依赖性增强作用
• 1.3.3 PRRSV的变异
• 1.4 糖基化在PRRSV研究中的应用
• 1.4.1 糖基化的研究
• 1.4.2 糖基化与PRRSV
• 1.4.2.1 GP5蛋白的糖基化研究状况
• 1.4.2.2 GP2a和GP4的糖基化研究
• 1.4.2.3 GP3蛋白的糖基化研究
• 1.5 研究的目的和意义
• 第二章 PRRSV GP3蛋白单糖基化位点突变株的构建及生物学特性分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞,毒株,菌株
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 糖基化位点分析
• 2.2.2 引物设计及合成
• 2.2.3 含糖基化位点突变质粒的构建
• 2.2.4 全长突变质粒的构建
• 2.2.5 病毒的拯救
• 2.2.5.1 重组质粒的线性化
• 2.2.5.2 含糖基化位点突变的全长DcNA的体外转录
• 2.2.5.3 体外转录获得RNA的纯化
• 2.2.5.4 病毒RNA的体外转染
• 2.2.5.5 病毒的传代
• 2.2.6 PRRSV HuN4-F112株含GP3突变糖基化位点感染性克隆的鉴定
• 2.2.7 拯救病毒的生物学特性分析
• 50测定'>2.2.7.1 病毒细胞TCID₅₀测定
• 2.2.7.3 拯救毒株的细胞病变观察
• 2.2.7.4 拯救病毒生长曲线绘制
• 2.3 结果
• 2.3.1 PRRSV特异性引物检测结果
• 2.3.2 拯救病毒ORF3序列测定
• 2.3.3 GENOMIC MALER检测结果
• 2.3.4 间接免疫荧光检测
• 2.3.5 拯救毒株的细胞病变观察
• 50测定'>2.3.6 拯救病毒的TCID₅₀测定
• 2.3.7 拯救病毒生长曲线的绘制
• 2.4 讨论
• 第三章 PRRSV GP3蛋白多糖基化位点突变株的构建及生物学特性分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 细胞,毒株,菌株
• 3.1.2 仪器与试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 多点突变全长质粒的构建
• 3.2.2 病毒的拯救
• 3.2.3 拯救病毒的鉴定
• 3.2.4. 拯救病毒生物学特性分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 PRRSV引物检测结果
• 3.3.2 检测GENOMIC MARKER
• 3.3.3 拯救病毒GP3蛋白序列测定
• 3.3.4 间接免疫荧光检测
• 3.3.5 细胞病变
• 50测定'>3.3.6 拯救病毒的TCID₅₀测定
• 3.3.7 生长曲线的检测
• 3.3.8 荧光定量PCR检测拯救病毒的表达量
• 3.4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历