龙眼胚胎发育相关基因F3H和FRK的克隆与分析

论文摘要

本研究以“立冬本”龙眼合子胚为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了龙眼胚胎F3H基因cDNA全长和FRK基因cDNA片段,并对F3H基因进行了原核表达的研究和序列分析,对揭示龙眼胚胎发育与分化的分子本质,对进一步利用基因工程技术培育优质果奠定实验基础。主要实验结果如下:1采用RT-PCR和RACE技术克隆了龙眼胚胎F3H基因cDNA全长龙眼胚胎F3H基因cDNA全长为1404bp,其中包含119bp的5′非编码区和187bp的3′非编码区,编码365个氨基酸,等电点为5.55,分子量为41.112kDa。对龙眼胚胎F3H基因cDNA编码产物进行分析,推断龙眼胚胎F3H基因为亲水性多肽。将该F3H基因cDNA序列与其它植物F3H基因cDNA进行比较,结果表明,龙眼胚胎F3H基因cDNA序列与许多植物的F3H基因具有很高的同源性,与棉花F3H的同源性达84%,与柑橘F3H的同源性达82%,与草莓F3H的相似系数达83%,对其所推导的氨基酸序列进行分析发现,龙眼F3H的氨基酸序列与棉花F3H同源性最高,达90.76%,与葡萄的同源性达89.04%,与柑橘的同源性达88.49%。该基因在GenBank中登录号为EF468104。2龙眼胚胎F3H基因cDNA的原核表达将分离出来的龙眼胚胎F3H基因cDNA的编码区序列插入pET-29a载体上构建原核表达载体,在细菌BL21细胞中进行原核表达。试验结果显示,该编码区片段在原核细胞中不表达。推测是由于表达质粒和表达宿主菌选择不当,不适合龙眼胚胎F3H基因的表达。3采用RT-PCR和RACE技术克隆了龙眼胚胎FRK基因cDNA片段试验获得了一个长850bp的FRK基因cDNA片段。经BLAST分析,龙眼胚胎FRK基因cDNA片段序列与许多植物的FRK基因具有很高的同源性。与柑橘FRK的同源性达87%,与番茄FRK的同源性达81%,与拟南芥FRK的同源性达75%。该cDNA片段在GenBank中登录号为EU600093。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词
• 引言
• 1 研究背景
• 2 植物胚胎发育相关基因的研究进展
• 2.1 概述
• 2.2 植物黄烷酮-3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase,F3H）基因的研究
• 2.3 植物果糖激酶（Fructokinase,FRK）基因的研究
• 3 RACE的研究及其在植物基因克隆上的应用
• 3.1 RACE原理
• 3.2 RACE技术的优点
• 3.3 RACE在植物基因克隆上的应用
• 4 研究展望
• 第一章 龙眼胚胎F3H基因cDNA全长的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器与试剂
• 1.3 引物合成与测序
• 1.4 龙眼胚胎总RNA的提取与纯化
• 1.4.1 龙眼胚胎总RNA的提取
• 1.4.2 龙眼胚胎总RNA的纯化
• 1.5 龙眼胚胎F3H保守区的克隆
• 1.5.1 引物设计
• 1.5.2 cDNA的合成
• 1.5.3 RT-PCR
• 1.5.4 目的片段的回收纯化
• 1.5.5 目的片段与T载体连接、转化及鉴定
• 1.6 3′RACE
• 1.6.1 3′RACE引物设计
• 1.6.2 3′-RACE-Ready cDNA的合成
• 1.6.3 3′末端的PCR扩增
• 1.6.4 目的片段的回收纯化 同本章1.5.4的方法
• 1.6.5 目的片段与T载体连接、转化及鉴定 同本章1.5.5的方法
• 1.7 5′RACE
• 1.7.1 5′RACE引物设计
• 1.7.2 5′-RACE-Ready DNA的合成
• 1.7.3 5′末端的PCR扩增
• 1.7.4 目的片段的回收纯化同本章1.5.4的方法
• 1.7.5 目的片段与T载体连接、转化及鉴定 同本章1.5.5的方法
• 2 结果与分析
• 2.1 龙眼胚胎总RNA的提取与纯度检测
• 2.2 龙眼胚胎F3H基因cDNA的RT-PCR扩增
• 2.3 龙眼胚胎F3H基因cDNA 3′RACE扩增
• 2.4 龙眼胚胎F3H基因5′RACE扩增
• 2.5 龙眼胚胎F3H基因cDNA全长序列分析
• 2.6 龙眼胚胎F3H基因cDNA序列及其编码产物的同源性分析
• 2.7 龙眼胚胎F3H蛋白结构分析
• 3 讨论
• 第二章 龙眼F3H基因的原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 酶及试剂
• 1.2 菌种与表达载体
• 1.3 引物合成与测序
• 1.4 F3H cDNA全开放阅读框的克隆
• 1.5 表达载体pET29a-F3H的构建
• 1.5.1 质粒DNA提取
• 1.5.2 pET29a载体和F3H-T Easy重组质粒的双酶切
• 1.5.3 连接载体片断和目的基因片断
• 1.5.4 连接产物的转化
• 1.5.5 重组质粒的检测
• 1.5.6 制备大肠杆菌BL21感受态细胞及连接产物的转化、筛选及重组质粒鉴定
• 1.5.7 目的基因的诱导表达及蛋白质样品制备
• 1.5.8 目的基因表达的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 表达载体的构建
• 2.2 表达产物的检测
• 3 讨论
• 第三章 龙眼胚胎FRK基因的cDNA克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器与试剂
• 1.3 引物合成与测序
• 1.4 龙眼胚胎总RNA的提取
• 1.5 龙眼胚胎FRK保守区的克隆
• 1.5.1 引物设计
• 1.5.2 cDNA的合成
• 1.5.3 RT-PCR
• 1.5.4 目的片段的回收纯化
• 1.5.5 目的片段与T载体连接、转化及鉴定
• 1.6 3′RACE
• 1.6.1 3′RACE引物设计
• 1.6.2 3′-RACE-Ready cDNA的合成
• 1.6.3 3′末端的PCR扩增
• 2 结果与分析
• 2.1 龙眼胚胎FRK基因cDNA的RT-PCR扩增
• 2.2 龙眼胚胎FRK基因cDNA 3′RACE扩增
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢