论文摘要
目的:使受损脊髓功能得到恢复依然是再生医学的难题。细胞移植被普遍认为是最有希望治疗脊髓损伤的策略之一,但其前景取决于移植物与脊髓断端融合,并有足够的轴突再生并跨过脊髓建立有效地连接。为此,利用组织工程支架材料、种子细胞等工程学技术重建脊髓的方法,是近年来研究的热点【1】。我们先前的研究业已表明应用化学萃取的家犬脊髓神经基膜样组织具有三维网状结构,可为人脐带间充质干细胞分化、增殖提供良好载体。最近,我们利用这种质地柔软的脊髓神经基膜样组织作为髓芯,外面包被用天然生物膜材料（国食药监械准字2006第3460627）做成的带有脑脊液通道的螺旋凸梁式圆管,制成脊髓生物支架。本实验目的是对这种新型脊髓支架与人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）的生物相容性进行了研究,为横贯性脊髓损伤动物模型及临床应用奠定基础。方法:1、脊髓生物支架内髓芯的制备:切取幼犬胸段脊髓长约5cm,浸入40ml/L TritonX-100的蒸馏水溶液在4℃冰箱中过夜;蒸馏水浸浴3h后放入40mM/L脱氧胆酸钠蒸馏水溶液中,置4℃冰箱12h。以上步骤重复4次。萃取后的髓芯分为三部分:大部分经无菌试验处理后置4℃冰箱待用,部分行电镜及冰冻切片观察,剩余部分通过真空冷冻干燥处理后保存。2、人脐带间充质干细胞培养:取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带,以PBS充分冲洗,剔除脐带动、静脉,将其余的脐带间质组织切割成直径约1mm大小的组织块,在含有20%的胎牛血清、2mM左旋谷氨酰氨（L-Glu）、100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的高糖型培养基（HG-DMEM）中培养。原代培养5-7天后,显微镜下可见大量细胞自组织块中游出,向外呈放射状贴壁生长。待10天左右,细胞达到80%-90%汇合后,加入0.2%胰酶消化传代。收集第三代MSCs经流式细胞学检测细胞表面抗原证实其为脐带间充质干细胞后冻存待用。3、将用天然生物膜材料做成的带有脑脊液通道的螺旋凸梁式圆管部分切开,作断面及内表面扫描电镜观察,剩余部分圆管套在已制备好的髓芯的上,置4℃冰箱待用。4、冻存的人脐带MSCs复苏后与脊髓生物神经支架相容性研究:对冻存的人脐带MSCs复苏使细胞密度达到1×10 6/ml,分点注入支架内,置入干细胞-支架体外培养液中培养,培养时间分别为48、72、96小时,应用冰冻切片及Hitachi扫描、透射电镜观察人脐带MSCs在不同时间点的生长发育情况。结果:1、经组织块原代培养约5天后,可见大量细胞自组织块游出,于周边向外贴壁呈放射状生长,形态较均一,呈长梭形。10天达到80%-90%汇合,镜下可见细胞胞浆丰富,轴突伸长,多角状。消化后以1:2-1:3的比例传代细胞,接种约30分钟后细胞迅速贴壁,经换液完全汇合时镜下可见细胞排列紧密,无序生长,经传代培养3代后细胞形态未见明显变化,经流式细胞学检测MSCs的标志抗原CD29、CD44、CD105均为阳性,HLA-D阴性,符合间充质干细胞特性。2、化学萃取后的脊髓依然呈长扁圆形,但直径有所增粗,后正中裂距离加宽,乳白色、质软。HE染色可见经化学方法萃取的脊髓横切片中无任何细胞,质地较致密,内可见蜂窝状网格。扫描及透射电镜可见去细胞髓芯的髓鞘、细胞等结构均消失,整个视野由板层样结构组成,神经纤维间基质和基底膜形成圆形较规则、均一的腔隙。特别是扫描电镜支架中存在神经元被化学萃取后残留的“空穴”,其大小与神经元直径（1.5-15um）相一致。真空冷冻干燥保存的髓芯肉眼下仍呈长扁圆形,但直径变小,硬度有所增加,断面可见组织块更加致密。3、天然生物膜材料肉眼下为带有脑脊液通道的螺旋凸梁式圆管状。生物膜圆管切开后,扫描电镜观察断面及内表面。断面可见该生物膜圆管呈分层状,由数层膜压制而成,而且部分膜之间夹有数层较厚的材料。内表面在电镜下观察可见胶原样结构呈蜂窝状。4、人脐带MSCs接种于包被生物膜圆管的脊髓生物支架内行体外条件养后,取48、72、96小时三个时间段,分别行冰冻切片HE染色、扫描电镜观察。冰冻切片HE染色见萃取的脊髓生物支架中有细胞在蜂窝样结构内生长,细胞呈点状、星芒状散居于间质之间,沿间质生长,并有突起伸长,经过一段时间部分细胞呈多角形。扫描电镜观察可见细胞黏附于网格样结构上,出现明显的神经球,细胞生长状态良好,其表面微绒毛结构清晰可见。神经球体积变大,生成多个突起,形成突触样结构。结论:冻存的人脐带MSCs复苏后注入自行研制的脊髓生物支架内进行体外培养,可见注入的人脐带MSCs在胶原纤维骨架上贴伏并生长良好,向神经元样细胞分化并逐渐生长,出现神经球,体积不断变大,生出突起,形成突触样结构,由此证实了外源性细胞与此种支架有良好的生物相容性,并且能向神经元样细胞分化,而髓芯的三维网格状结构又为细胞的生长提供了适宜的微环境。无疑,这种脊髓生物支架联合人脐带MSCs移植为脊髓横断性损伤修复提供了一种新思路和实验理论依据。