具有不同疏水性的聚阴离子诱导脱辅基细胞色素c和细胞色素c的结构转换

论文摘要

蛋白质的结构转换（折叠与去折叠）是蛋白质研究的重要领域。蛋白质的正确折叠是体现其生物功能的基础，也是生物学中最基本和最普遍的自组装模式。蛋白质肽链在体内如何折叠主要取决于其一级结构和肽链所位于的细胞环境，一般来说，蛋白质能自发地折叠成具有特定空间结构和生物功能的分子。但是环境因素的改变会使肽链发生结构转换，也就是说蛋白质采取何种空间结构不但受肽链自身热力学稳定性的控制，还受到蛋白质分子所处的微环境和动力学过程的影响。蛋白质的结构转换在生物体内是一个普遍现象，近年来的医学研究发现，蛋白质在人体内的结构转换和错误折叠会引起严重的疾病；另一方面，重组蛋白质在大肠杆菌中的高效表达常常导致无活性的变性蛋白质聚集体，即包涵体的生成。因此，研究蛋白质的折叠机理和发展促使蛋白质复性的方法无论在理论上还是在应用上都有很重要的意义。在细胞内，有一类称为分子伴侣（molecular chaperone）的蛋白质分子协助新生肽链进行正确的非共价键组装。分子伴侣对其靶蛋白并没有特异性识别，本身不参与最终产物的形成，也不包括控制正确折叠所需要的构象信息，而只是阻止非天然的多肽链内部或多肽链之间不正确的相互作用。分子伴侣协助蛋白质折叠的方法为蛋白质复性提供了一个可能性。90年代初，Cleland及合作者报道了两亲性的合成高分子聚乙二醇（PEG）可以作为蛋白质折叠促进剂。近年来，又有一些关于高分子作为折叠促进剂的报道。随着高分子科学的迅速发展，已经可以按照高分子功能性的要求设计和合成出具有指定单体单元结构、链结构、分子量的多种均聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物等。尤其重要的是，可以通过分子设计将具有环境响应性质的疏水和亲水的结构单元以不同的组合方式连接于合成高分子中，它们不但在单分子状态具有可调节和环境响应的结构变换及疏水一亲水平衡，还能形成可控尺寸的自组装。因此，可以利用不同的合成高分子研究各种作用力对蛋白质折叠的影响，并寻找合成高分子促进蛋白质折叠的结构模式。在本论文中，用磺化聚苯乙烯、马来酸—烯烃交替共聚物研究了静电、疏水作用和氧键对细胞色素c和脱辅基细胞色素c结构的影响。细胞色素c是一个碱性蛋白质，等电点为pH 10.6；脱辅基细胞色素c是细胞色素c的前体蛋白质，不含辅基血红素，在溶液中以无规卷曲构象形式存在。论文工作的第一部分研究了磺化聚苯乙烯和脱辅基细胞色素c的相互作用。龚洁在前期的研究中，发现磺化聚苯乙烯可以诱导脱辅基细胞色素c从无规卷曲构象折叠为α-螺旋结构。脱辅基细胞色素c的α-螺旋含量与磺化聚苯乙烯的分子量、磺化度、浓度以及溶液的pH、离子强度有关。在此基础上，我用动态光散射、荧光光谱和原子力显微镜方法对磺化聚苯乙烯和脱辅基细胞色素c的相互作用进行了进一步地表征。我们发现，滴加磺化聚苯乙烯溶液（THF／H2O，50／50，v／v）到水溶液中可以形成纳米粒子，粒子表面的磺酸负电荷使其稳定地分散在水溶液中；粒径的大小与聚合物浓度和低浓度的盐无关，但随溶液pH的增加而增加。在酸性和中性溶液中磺化聚苯乙烯和脱辅基细胞色素c发生相互作用形成复合物粒子，其尺寸与两者的浓度比有关。当磺化聚苯乙烯过量时，富集在复合物粒子表面的负电荷阻止了粒子的进一步聚集；而当脱辅基细胞色素c过量时，脱辅基细胞色素c可能促使复合物粒子进一步聚集。以芘为探针的荧光光谱表明，脱辅基细胞色素c不仅中和了磺化聚苯乙烯粒子表面的负电荷，而且可能插入其疏水内核，破坏了磺化聚苯乙烯粒子的原始结构，这类似于脱辅基细胞色素c与磷脂的反应。因此，磺化聚苯乙烯粒子可以部分地模拟磷脂膜的微环境。论文工作的第二部分研究了马来酸—烯烃交替共聚物对脱辅基细胞色素c结构转换的影响。马来酸—烯烃交替共聚物的疏水—亲水性可以通过选择不同长度的疏水侧链和溶液的pH来进行调节，因此是研究静电、疏水和氢键作用对蛋白质结构转换影响的一个很好模型。在这里，我选择了马来酸—十四烯交替共聚物（PTMA）和马来酸—异丁烯交替共聚物（PIMA）来研究对脱辅基细胞色素c折叠的诱导作用。在pH为2.1，6.5，10.5和11.8溶液中，PIMA的电离度分别为11％，53％，87％和100％；PTMA电离度分别为8％，55％，97％和100％。在水溶液中，亲水的PIMA链主要采取伸展的构象；而疏水的PTMA聚集形成胶束，位于胶束表面的羧酸根负离子使胶束稳定。当溶液中PTMA浓度降低和pH增大时，胶束会发生解离。圆二色性光谱、荧光光谱和原子力显微镜研究表明，当溶液pH从酸性变到碱性时，脱辅基细胞色素c从伸展的无规卷曲构象，即UA态转变为聚集的无规卷曲构象，即C态。加入马来酸—烯烃交替共聚物后，脱辅基细胞色素c从无规卷曲构象转变为α-螺旋结构。α-螺旋含量与共聚物的浓度、疏水链的长度以及溶液的pH有关。在pH 2.1时，每个脱辅基细胞色素c分子带有24个正电荷，因此共聚物和蛋白质之间的静电吸引作用可以削弱肽链内的静电斥力，有利于蛋白质折叠。在pH 11.8时，共聚物和蛋白质都带负电荷，PIMA的烷基侧链太短，不能诱导脱辅基细胞色素c折叠；而带有十四烷基侧链的PTMA仍然可以诱导脱辅基细胞色素c形成α-螺旋结构，说明疏水作用也是诱导蛋白质折叠的一个重要因素。蛋白质和共聚物之间的静电和疏水作用排挤了与蛋白质结合的水分子，减少了蛋白质与水分子之间的氧键，促进了肽链内部氢键，从而有利于α-螺旋结构的形成。另外，共聚物中离子化的羧酸基团可以和蛋白质肽链上的酰胺基团形成强氢键，抑制肽链内氢键和α-螺旋结构的形成。动态光散射研究表明，在溶液pH小于蛋白质等电点时，当正负电荷比接近化学计量时，共聚物和脱辅基细胞色素c相互作用会生成沉淀；否则，过量的脱辅基细胞色素c正电荷或过量的共聚物负电荷可以防止复合物的进一步聚集而形成稳定的粒子。在中性和碱性溶液中，共聚物和蛋白质之间的相互作用破坏了PTMA和脱辅基细胞色素c自身的疏水聚集，形成了新的聚集体。在体系中，共聚物与脱辅基细胞色素c之间的相互作用和共聚物与蛋白质自身的疏水聚集之间存在竞争。相对于小分子折叠促进剂，用高分子诱导蛋白质折叠有两个优点：（1）浓度低：（2）相互作用可调。论文工作的第三部分研究了在与马来酸—烯烃交替共聚物结合和解离过程中细胞色素c结构的可逆转换。球蛋白与带相反电荷的聚合物相互作用后，根据溶液中聚合物与蛋白质浓度以及溶液pH和离子强度的不同，可以生成可溶性的复合物、凝聚物或沉淀。因此，聚合物可以用来分离和纯化蛋白质、固定和稳定酶、促进蛋白质折叠、包埋与控制释放蛋白质。聚合物和蛋白质之间可以发生静电、疏水和氢键相互作用，而这些相互作用也是维持蛋白质结构的重要因素和诱导蛋白质结构转换的主要驱动力。据我们所知，目前还没有关于聚合物和蛋白质之间的结合和释放对蛋白质结构影响的系统研究。因此，我用圆二色性光谱、吸收光谱和原子力显微镜研究了PIMA与PTMA分别和细胞色素c结合和解离过程中静电和疏水作用对蛋白质结构的影响。在生理pH 7.4时，PIMA仅部分地破坏了细胞色素c中血红素疏水袋结构的完整性而对色氨酸的不对称环境没有影响，而PTMA完全破坏了细胞色素c中血红素疏水袋结构的完整性和色氨酸的不对称环境，即PTMA与细胞色素c之间的疏水作用完全破坏了细胞色素c的疏水核结构。二者均对细胞色素c的二级结构没有明显影响。在马来酸—烯烃交替共聚物和蛋白质复合物中，加入相当于生理离子强度的0.15 M NaCl可以破坏PIMA和细胞色素c的复合物粒子，被释放出的细胞色素c恢复其天然结构；相反，由于PTMA和细胞色素c之间更强的疏水作用，0.15 M NaCl对其没有明显的影响。加入0.5M盐酸胍到PTMA和细胞色素c复合物中，盐酸胍可以与PTMA发生静电和疏水作用生成PTMA—盐酸胍沉淀而将细胞色素c释放出来，被释放的细胞色素c恢复了天然结构。这表明，聚合物可以通过疏水作用与蛋白质形成更稳定复合物，同时蛋白质的结构也被更严重地破坏，但是释放后的细胞色素c仍然可以恢复其天然结构。这个结论对利用聚合物分离和纯化蛋白质、固定和稳定酶、促进蛋白质折叠、包埋与控制释放蛋白质的研究中将会有所帮助。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 稳定蛋白质三维结构的作用力
• 1.1.1 疏水作用
• 1.1.2 静电作用
• 1.1.3 氢键
• 1.1.4 范德华作用力
• 1.2 蛋白质的结构转换
• 1.3 研究蛋白质结构转换的必要性
• 1.3.1 蛋白质折叠是生物学的基础问题
• 1.3.2 蛋白质的结构转换与疾病
• 1.3.3 重组蛋白质的折叠
• 1.4 蛋白质结构转换的研究方法
• 1.4.1 蛋白质去折叠的研究方法
• 1.4.2 蛋白质折叠的研究方法
• 1.5 细胞色素C
• 1.6 实验设计
• 参考文献
• 第二章 磺化聚苯乙烯的自组装以及与脱辅基细胞色素c的相互作用
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 样品的制备
• 2.2.3 稳态荧光光谱测试
• 2.2.4 动态光散射测试
• 2.2.5 原子力显微镜（AFM）测试
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 脱辅基细胞色素c的制备表征
• 2.3.2 SPS在水溶液中的自组装
• 2.3.3 PSS与脱辅基细胞色素c的相互作用
• 2.3.4 SPS与脱辅基细胞色素c的相互作用
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 马来酸—烯烃交替共聚物诱导脱辅基细胞色素c折叠
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 样品的制备
• 3.2.3 电位滴定
• 3.2.4 园二色性光谱
• 3.2.5 荧光光谱法
• 3.2.6 动态光散射
• 3.2.7 原子力显微镜
• 3.2.8 表面等离子共振
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 马来酸—烯烃交替共聚物
• 3.3.2 脱辅基细胞色素c在水溶液中的结构表征
• 3.3.3 马来酸—烯烃交替共聚物诱导脱辅基细胞色素c的折叠
• 3.3.4 马来酸—烯烃交替共聚物和脱辅基细胞色素c的相互作用机制研究
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 与马米酸—烯烃交替共聚物结合、解离过程中细胞色素c结构的可逆变化
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 样品制备
• 4.2.3 园二色性光谱
• 4.2.4 紫外—可见吸收光谱
• 4.2.5 原子力显微镜
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 马来酸—烯烃交替共聚物诱导细胞色素c去折叠
• 4.3.2 温度的影响
• 4.3.3 氯化钠的影响
• 4.3.4 盐酸胍的影响
• 4.3.5 原子力显微镜表征细胞色素c与马来酸—交替共聚物的结合以及释放
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 作者简介
• 后记