用于诊断四种猪疫病病毒寡核苷酸芯片的研制

论文摘要

高发性呼吸系统、生殖系统、神经及免疫系统主要病毒性病原的混合感染和持续感染，使得集约化养猪业疫病流行状况呈现高度复杂化、多样化趋势，进而增加了临床和实验室诊断难度。目前，对猪疫病病毒性病原的诊断仍采用传统的病原分离和免疫血清学方法，其操作费时费力且灵敏度不高。分子生物学诊断方法如：PCR、标记探针杂交等技术的应用，虽然具有灵敏度高、特异性强、快速、简便的特点，但其假阳性率较高且一次仅能检测一种或同时检测两三种病毒。基于上述技术的缺点，本研究应用寡核苷酸芯片技术，结合不对称PCR和间接荧光标记技术，制备一款低密度猪疫病病原诊断基因芯片，以满足目前集约化养猪生产中流行性病疫原快速、准确、高通量的检疫要求。本研究确定集约化养猪业常见的4种猪疫病病毒：猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪蓝耳病毒作为检测对象。根据四种不同病毒的保守区域设计扩增短片断（100-300 bp）PCR产物的特异性引物。依据每种短片断PCR产物序列，筛选出四条高度特异、长度相同、Tm值和G+C％含量接近的检测探针，并将其固定在氨基化修饰的片基上，制备成低密度60-mer寡核苷酸诊断芯片。通过标记样本与检测探针在固液相体系中杂交，一次试验可完成对这四种猪疫病病毒的诊断。在实验过程中，对芯片上探针点样浓度的选择，每种病毒选择正义链或是反义链探针作为检测探针以及杂交条件等实验过程进行探索和优化。以上述四种猪疫病病毒为检测模型，对经过优化的猪疫病病毒诊断基因芯片集成系统的灵敏度和特异性进行评估和鉴定。通过一系列试验，本研究取得如下的成果：（1）制作出背景低、固定效率高的（?）病毒性疫病原多重检测的基因芯片；（2）通过优化实验，确定了芯片上探针（?）浓度的最佳浓度为25μM；（3）不对称PCR体系中通过变换上下游引物作为限制性引物，杂交后结果进行比较，最终确定猪流感病毒、猪伪狂犬病毒及口蹄疫病毒以反义链探针作为检测探针，而猪蓝耳病毒则以正义链探针作为检测探针；（4）通过用间接荧光标记技术引入荧光基团，在杂交温度为60℃，杂交时间为10h的条件下，能够获得特异性强、稳定性高的荧光信号；（6）从杂交结果可以看到四种猪疫病病毒均可在在对应的检测探针位置处被检出，没有假阳性结果出现，各个病毒之间也没有出现交叉杂交的现象。芯片检测四种猪疫病病毒靶基因的最低检测限分别是：猪流感病毒7.59×102个／mL，猪伪狂犬病毒2.36×104个／mL，口蹄疫病毒6个／mL，猪繁殖与呼吸综合症病毒5.05×102个／mL。

论文目录

• 英文缩写词表
• 中文摘要
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• 第一部分 文献综述
• 1. 集约化养猪业常见的猪疫病病毒及常规诊断技术
• 1.1 常见的四种猪疫病病毒
• 1.2 四种猪疫病病毒诊断技术的现状
• 2. 基因芯片技术及其在病毒诊断中的应用
• 2.1 基因芯片技术
• 2.2 基因芯片技术在病毒诊断中的应用
• 2.3 基因芯片诊断的优势
• 3. 本研究的目的、意义及主要内容
• 3.1 研究目的
• 3.2 研究意义
• 3.3 主要内容
• 第二部分 实验部分
• 1. 材料与仪器
• 1.1 所需材料及试剂
• 2. 实验方法
• 2.1 特异性引物和寡核苷酸探针的设计
• 2.2 猪疫病病毒重组质粒的构建
• 2.3 60-mer 寡核苷酸芯片的制备
• 2.4 样品的处理
• 2.5 芯片杂交、清洗、扫描及结果分析
• 2.6 结果判读
• 2.7 灵敏度试验
• 2.8 芯片检测条件的优化
• 3. 实验结果
• 3.1 质粒的鉴定结果
• 3.2 寡核苷酸芯片质检结果
• 3.3 引物特异性的验证结果
• 3.4 不对称 PCR 引物比例的选择
• 3.5 不对称 PCR 单链产物的验证结果
• 3.6 芯片特异性试验结果
• 3.7 灵敏度试验结果
• 3.8 优化试验结果
• 4. 讨论
• 4.1 基因芯片技术在猪疫病病毒诊断上的应用
• 4.2 寡核苷酸芯片片基的选择
• 4.3 寡核苷酸探针的选择
• 4.4 样品的处理方法
• 4.5 60-mer寡核苷酸诊断芯片的灵敏度
• 4.6 基因芯片杂交结果判定
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间的研究成果