论文摘要
目的：健康人来源的牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）是牙周组织中的成体干细胞,具有自我更新能力和多项分化潜能,国内外学者研究发现筛选的牙周膜干细胞可分别形成骨样结构（体外诱导）和成牙本质样结构（动物体内实验）。但是2型糖尿病伴牙周炎状态下的PDLSC自我更新能力和多项分化能力的研究并未见报道,本实验拟从基因、蛋白水平观察2型糖尿病患者PLDSCs多项分化能力。通过体外扩增培养正常人、牙周炎患者和2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜成纤维细胞,经过筛选和鉴定PDLSC,比较体外培养的正常人牙周膜干细胞（H-PDLSC）、牙周炎患者牙周膜干细胞（P-PDLSC）和糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞（D-PDLSC）自我更新和成骨成脂分化的能力,进而从PDLSC的功能变化解释2型糖尿病患者牙周炎患病率高的临床现象。方法：本实验采用体外组织块法体外培养正常人、牙周炎患者和2型糖尿病伴牙周炎患者前磨牙或第三磨牙牙周膜成纤维细胞,通过有限稀释法分别筛选PDLSCs,即原代细胞低密度接种后待克隆细胞增殖到孔底80%后胰酶消化并常规培养,通过计算克隆形成率、免疫荧光细胞化学、流式细胞技术检测细胞表型分子对PDLSCs进行初步干细胞鉴定；MTT法、流式细胞周期检测比较H-PDLSC、P-PDLSC和D-PDLSC增值能力；利用成骨、成脂诱导液分别对三组干细胞进行成骨、成脂诱导21天,茜素红、油红O染色观察钙化结节、脂滴形成情况；连续9天观察三组干细胞成骨诱导期间ALP活性；实时定量聚合酶链反应（real time PCR, RT-PCR）检测诱导7天后的成骨基因（ALP、RUNX-2、BSP、OCN、Col-1）和成脂基因（LPL、PPAR）表达,同时利用Western Blot技术进一步验证RT-PCR结果。结果：（1）干细胞的分离与初步鉴定：成功培养H-PDLSC 10例,P-PDLSC 7例,D-PDLSC 3例,有限稀释法筛选的PDLSCs细胞形态并无明显差异,均呈长梭形、胞体丰满的成纤维样细胞；免疫荧光细胞检测发现,三组干细胞波形丝蛋白均阳性表达,细胞角蛋白阴性表达；同时标记细胞表型分子CD146和STRO-1,经Image-Pro Plus软件分析D-PDLSC表型分子CD146和STRO-1阳性细胞量表达较P-PDLSC和H-PDLSC低（P<0.05）,STRO-1阳性细胞百分比分别为：62.6±1.6%（H-PLDSC）、40.6±2.5%（P-PDLSC）和27.2±1.6%（D-PDLSC）,差异有统计学意义（P<0.05）；CD146阳性细胞百分比分别为：69.6±3.4%（H-PLDSC）、48.9±1.6%（P-PDLSC）和32.1±0.9 %（D-PDLSC）,差异有统计学意义（P<0.05）,同时经流式细胞技术检测CD14、CD34、CD29、CD90和STRO-1等表型分子进一步确认了干细胞的来源及其干细胞特性。（2）干细胞自我更新和增值能力比较：H-PDLSC、P-PDLSC和D-PDLSC具有一定的自我更新能力,克隆形成率分别为：36.8±4.9%、25.0±2.3%和17.8±2.1%, D-PDLSC克隆形成率较P-PDLSC（P<0.05）和H-PDLSC均低（P<0.001）,差异有统计学意义；MTT法连续七天对三种细胞增值情况比较得出,相同培养条件下,D-PDLSC增值能力较P-PDLSC和H-PDLSC均弱,差异有统计学意义（P<0.01）,同时通过对三种细胞进行流式细胞周期检测,发现D-PDLSC的S+M期和G2/G1期细胞数量较少,进一步证实了D-PDLSC细胞增殖能力较P-PDLSC和H-PDLSC弱。（3）成骨成脂分化诱导能力比较：成骨成脂诱导液分别对三组干细胞诱导21天,经Image-Pro Plus软件分析,发现相同视野下,H-PDLSC诱导后钙化结节和脂滴面积形成最多,P-PDLSC次之,D-PDLSC最少；另外,通过RT-PCR检测诱导一周后的RUNX-2、ALP、BSP、OCN和Col-1成骨基因和PPAR y.LPL成脂基因,发现D-PDLSC成骨、成脂相关基因的表达均低,差异有统计学意义（P<0.05）。同时Western Blot技术验证了RT-PCR结果。（4） H-PDLSC、P-PDLSC和D-PDLSC炎性因子检测：诱导前通过RT-PCR技术比较三组干细胞炎性因子IL-6和TNF-α表达情况。结果显示,与H-PDLSC比较,D-PDLSC IL-6和TNF-α表达最高,P-PDLSC次之,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：本实验首次从糖尿病伴牙周炎患者中成功提取牙周膜干细胞,并且通过干细胞鉴定,虽然与H-PDLSC和P-PDLSC比,D-PDLSC细胞形态并无明显的差别,但在特异性干细胞表型分子表达和干细胞的自我更新方面,同时也证明了,D-PDLSC与H-PDLSC—样,具有干细胞特性；通过对三种干细胞成骨、成脂方向诱导结果分析,可以从干细胞的角度可以初步解释临床上2型糖尿病患者牙周病患病率高、病变严重的原因：可能是2型糖尿病状态通过降低牙周膜干细胞的自我更新和分化能力,从而加速了牙周组织的破坏,特别是阻碍或抑制牙周膜新附着的形成和牙周膜干细胞向牙槽骨分化,导致牙周袋的形成。