白菜低温要求型晚抽薹性的相关序列克隆与分析

论文摘要

大白菜（Brassic campesstris L ssp．pekinensis）属于二年生蔬菜作物，需要经历一个低温阶段才能完成从营养生长到生殖生长的转变而抽薹开花。而春季栽培温度由低到高的变化和日照长度的增加，极有利于大白菜的生殖生长而导致未熟抽薹，给生产造成巨大的损失，而解决问题的根本途径是培育和种植晚抽薹的大白菜品种。为了阐明低温要求型晚抽薹的分子机制，本研究利用易抽薹大白菜“BY”和晚抽薹芜菁“M．M”杂交获得的81个DH系群体为试材，从中选择了6个极早抽薹和6个极晚抽薹的株系分别组成早抽薹池和晚抽薹池。以两池和双亲为样本，以无低温和3-5℃处理25天后获得的mRNA为模板，反转录为cDNA，利用256对AFLP引物组合进行cDNA-AFLP分析，筛选与白菜晚抽薹性相关的特异片段。获得3条差异表达、且丰度较高的cDNA片段并进行了克隆测序。序列测定和Blast分析表明，p65m47cDNA片段与C2结构域蛋白基因有80％的同源性，期望值为7e-17，C2结构域蛋白在细胞的信号转导中起着很重要的作用；p66m55cDNAⅠ片段与拟南芥AT1G32530cDNA有85％的同源性，期望值为5e-36，它编码蛋白结合位点/泛素连接酶/锌指结合蛋白；p66m55cDNAⅡ片段与拟南芥AT1G65590cDNA有87％的同源性，期望值为4e-37，它编码β-N-乙酰已糖胺水解酶。以上三个片段都是在无低温时早抽薹和晚抽薹品系都有表达而低温春化处理后通过春化作用的早抽薹品系缺失的片段，其表达特性和功能尚需进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 略缩词（Abbreviation）
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 国内外大白菜晚抽薹的研究现状
• 1.2 春化作用及春化基因
• 1.2.1 开花转变及影响开花转变的因子
• 1.2.2 植物向生殖生长转变的模式
• 1.2.3 与开花转变有关的基因
• 1.2.3.1 晚开花突变
• 1.2.3.2 早开花突变
• 1.2.3.3 开花时间的天然变异
• 1.2.4 控制开花转换的遗传途径
• 1.2.4.1 光周期途径（The Photoperiod Pathway）
• 1.2.4.2 春化途径（The Vernalization Pathway）
• 1.2.4.3 自主途径（The Autonomous Pathway）
• 1.2.4.4 赤霉素途径（The Gibberellin Pathway）
• 1.2.5 开花途径整合子（Floral Pathway Integrators）
• 1.2.6 开花时间抑制基因
• 1.2.7 植物通过春化作用的条件
• 1.2.8 春化作用的机理
• 1.2.9 高等植物中春化基因的研究现状
• 1.2.9.1 FRI和FLC的协同增效作用决定植物对春化作用的需求
• 1.2.9.2 春化作用对FLC的负调控作用
• 1.2.9.3 其他与春化作用有关的基因
• 1.3 植物基因分离的方法
• 1.3.1 基于基因序列（DNA）的分离方法
• 1.3.2 基于基因转录产物的分离方法
• 1.3.2.1 差示筛选（differential hybridization）
• 1.3.2.2 扣除杂交（subtractive hybridization of cDNA,SHD）
• 1.3.2.3 mRNA差别显示（mRNA differential display,DD）
• 1.3.2.4 代表性差示分析（represential display analysis,RDA）
• 1.3.2.5 抑制性扣除杂（suppression subtractive hybridization,SSH）
• 1.3.2.6 基因表达连续分析法（serial analysis of gene expression,SAGE）
• 1.3.2.7 交互式扣除RNA差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display,RSDD）
• 1.3.2.8 cDNA-AFLP技术
• 1.3.3 基于基因转译产物的分离方法
• 1.3.4 基于基因功能的分离方法
• 1.3.4.1 功能互补
• 1.3.4.2 酵母双杂交体系
• 1.3.5 基于基因位置的分离方法
• 1.3.6 图位克隆
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA的提取
• 2.2.1.1 器皿的准备
• 2.2.1.2 试剂
• 2.2.1.3 仪器
• 2.2.1.4 提取RNA的步骤
• 2.2.1.5 RNA的检测
• 2.2.2 cDNA的合成
• 2.2.2.1 1st strand cDNA合成反应
• 2.2.2.2 2nd strand cDNA合成反应以及末端平滑化
• 2.2.2.3 合成的cDNA精制
• 2.2.3 与晚抽薹相关的cDNA-AFLP差异片段的筛选
• 2.2.3.1 酶切及与接头连接
• 2.2.3.2 预扩增
• 2.2.3.3 选择性扩增
• 2.2.3.4 聚丙烯酰胺胶的制备
• 2.2.3.5 测序胶电泳
• 2.2.3.6 银染
• 2.2.4 与晚抽薹相关的cDNA-AFLP目标片段的获得
• 2.2.4.1 AFLP产物的重扩增
• 2.2.4.2 目标片段的回收纯化
• 2.2.4.3 目标片段与载体的连接
• 2.2.4.4.目标片段的克隆
• 2.2.4.4.1 重组质粒的转化
• 2.2.4.4.2 重组质粒的筛选
• 2.2.4.4.3 重组质粒DNA的提取
• 2.2.4.4.4 重组质粒的酶切检测
• 2.2.4.4.5 目标片段的测序
• 2.2.4.4.6 测序结果的Blast结果分析
• 3 结果与分析
• 3.1 基因组RNA的提取质量
• 3.2 cDNA的合成
• 3.3 预扩增的检测
• 3.4 双亲和早抽薹池及晚抽薹池之间多态性AFLP引物的筛选分析
• 3.5 cDNA-AFLP特异片段的筛选
• 3.6 特异AFLP片段的回收与纯化
• 3.7 重组质粒的筛选
• 3.8 特异片段的测序结果和Blast
• 讨论
• 4.1 关于运用BSA法筛选cDNA-AFLP差异基因片段
• 4.2 关于RNA的提取
• 4.3 关于cDNA-AFLP的技术及其优点
• 4.4 关于银染的一点心得体会
• 4.4.1 显影液的提前预冷
• 4.4.2 染色后漂洗时间的控制
• 4.4.3 关于甲醛的挥发问题
• 4.5 差异片段的连接和转化问题
• 4.6 关于测序后Blast结果的思考
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介