封闭连续细胞培养生产流感病毒工艺过程关键技术的研究

论文摘要

流行性感冒是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病,在季节性流行时,能在全世界迅速传播,造成大量的经济损失和社会危害,全世界每年约有10亿人口感染流感病毒,其中重症病例300～500万,死亡人数25～50万,免疫接种流感疫苗仍是最为有效和经济的方式。与传统鸡胚生产方法相比,动物细胞培养生产流感方法具有很多优势,如抗原匹配性好,能够实现大规模生产和自动化控制,可以在短时间内大量生产流感疫苗,减少过敏反应等。世界卫生组织鼓励各国发展细胞培养技术生产流感疫苗。针对目前细胞培养生产流感病毒的现状,本文首次提出了一个包括细胞培养、病毒生产和病毒灭活在内的封闭、连续、在位灭活的细胞培养生产灭活病毒疫苗新工艺。通过连续操作,能够在较少空间内快速大量生产病毒。通过将细胞培养和病毒生产过程分开,可以把病毒生产过程安置在一个较小的高安全等级空间内进行,大大提高了操作安全性和降低了病毒泄漏危险性,尤其适合那些高致病性、高危险性病毒疫苗的制备过程。通过使用Vero细胞增殖禽流感病毒H9N2,本文针对封闭连续工艺过程的一些关键技术开展研究,包括细胞对流感病毒敏感性分析、细胞微载体培养生产病毒工艺、细胞珠到珠转移、转移后细胞对病毒增殖敏感性验证、细胞无血清培养生产流感病毒、代谢分析、可模拟连续操作的多次间歇式珠到珠转移培养细胞生产流感病毒等方面。首先考察Vero细胞对H9N2禽流感病毒的敏感性。发现H9N2病毒经过在Vero细胞上连续传代,会逐渐适应,可以产生高血凝滴度的流感病毒,当TPCK胰酶为1.5μg/mL,pH值7.07.6时,血凝滴度可达2.22.3 logHA unit/100μL。为了规模化培养,研究了细胞微载体培养生产流感病毒的可行性,发现细胞最适培养条件是:接种密度为2.0×105cells/mL、Cytodex3含量为2g/L、转速35rpm。3天左右,微载体上基本长满细胞,细胞密度约为9.7×105cells/mL。接着用DMEM培养基生产流感病毒H9N2,当感染复数为0.1时,病毒感染48h后,空斑形成单位达到最大值,约为5.8 logPFU /mL,此时收集病毒,可以适合减毒活疫苗的制备;病毒感染6072h后,病毒HA滴度达到最大值,约为2.12.2logHA unit/100μL,此时收集病毒,适合灭活疫苗的制备。接下来考察Vero细胞在Cytodex 3微载体间通过珠到珠转移的可行性,发现Vero细胞主要依靠载体间形成的细胞桥实现珠到珠转移, 5μg/mL胰酶并不能促进细胞在载体间转移。本文应用田口方法首次分析了影响建桥率的因素。搅拌时间、静止时间两个因素和搅拌时间/静止时间、搅拌速度/静止时间两个相互作用对新老微载体之间细胞桥的形成过程有显著影响。在新老载体比例为2:1的放大中,间歇搅拌8 h,新载体建桥率在21%左右,然后以35 rpm连续搅拌,新老载体混合6天后,载体空载率降到2%左右,细胞密度达到1 .3×106 cells/mL。Vero细胞珠到珠转移后,接种流感病毒,血凝滴度逐渐增加,4天后稳定在2.12.2logHA unit/100μL,说明珠到珠转移方法适合Vero细胞生产流感病毒,这为流感病毒扩大生产提供了一条简单路线。本文又首次考察了EX-CELLTM Vero无血清培养基培养Vero细胞生产流感病毒的情况。发现Cytodex 3比Cytodex 1对Vero细胞的接种效率更高,采用每隔30 min以35rpm转速搅拌3min的间歇搅拌方式,在200 mg/L CaCl2促进下,经过8h间歇搅拌,细胞接种效率在53%左右。无血清培养可以培养Vero细胞生产流感病毒,其中细胞生长速度比用含血清培养基培养时慢,需要4天到达稳定生长期,但病毒增殖情况在两者中没有明显差异。同时发现无血清培养细胞后无需换液,直接接种病毒,仍能够获得满意的病毒增殖效果,病毒滴度在2.1logHA unit/100μL左右,这对生产工艺过程的简化十分有利。由于受实验条件的限制,本实验采用多次间歇加料的方式来模拟连续培养过程,经过4次新老载体1:4比例的放大培养,发现细胞密度可以保持稳定,而病毒产量有轻微下降的趋势,这可能是由于病毒生长环境比较恶劣的缘故。最后,本文还对悬浮细胞生产流感病毒的封闭连续系统进行了展望,对有关动力学参数的测定建立了相关数学公式模型,希望能够对其它细胞系和高致病性、高危险性病毒的封闭连续大规模生产提供参考和借鉴。

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第一章绪论

1.1 流感病毒和流感疫苗

1.1.1 流感病毒结构

1.1.2 流感病毒分类与抗原多变性

1.1.3 流感疫苗的种类

1.2 动物细胞生产流感疫苗研究

1.2.1 开展动物细胞培养生产流感疫苗技术研究的重要性

1.2.2 生产流感病毒疫苗常用细胞系

1.2.3 细胞培养生产流感病毒常用反应器系统

1.2.4 影响搅拌式生物反应器系统生产流感病毒因素分析

1.3 微载体培养过程中细胞放大培养方式

1.4 细胞培养及病毒生产过程中代谢分析

1.5 课题目的和意义

1.6 实验设计

第二章 VERO 细胞微载体培养生产流感病毒

2.1 前言

2.2 实验材料、仪器和试剂

2.2.1 材料

2.2.2 主要仪器和设备

2.2.3 主要试剂

2.3 实验方法

2.3.1 流感病毒在鸡胚中接种

2.3.2 Vero 细胞复苏和培养皿培养

2.3.3 H9N2 禽流感病毒在Vero 细胞上的传代适应

2.3.4 TPCK-胰酶含量对流感病毒增殖的影响

2.3.5 pH 值对流感病毒增殖的影响

2.3.6 Cytodex 3 微载体处理

2.3.7 Vero 细胞微载体培养

2.3.8 Vero 细胞接种密度的确定

2.3.9 微载体含量的确定

2.3.10 搅拌转速的确定

2.3.11 流感病毒微载体培养和感染复数MOI 的确定

2.3.12 流感病毒在Vero 细胞上增殖最适收毒时间的确定

2.3.13 流感病毒血凝滴度测定

2.3.14 病毒空斑测定

2.3.15 细胞结晶紫计数方法

2.3.16 生长动力学分析

2.3.17 实验试剂与配制方法

2.4 结果与分析讨论

2.4.1 流感病毒在Vero 细胞上传代适应

2.4.2 TPCK-胰酶含量对流感病毒增殖的影响

2.4.3 pH 值对流感病毒增殖的影响

2.4.4 Vero 细胞的微载体培养

2.4.5 流感病毒微载体培养和感染复数MOI 对病毒增殖的影响

2.4.6 流感病毒在转瓶中增殖最适病毒收获时间的确定

2.5 本章小结

第三章珠到珠转移扩大培养 VERO 细胞和生产流感病毒研究

3.1 前言

3.2 实验材料、仪器和试剂

3.3 实验方法

3.3.1 Vero 细胞的微载体培养

3.3.2 Vero 细胞珠到珠转移过程建桥效率分析

3.3.3 田口正交实验设计

3.3.4 Vero 细胞珠到珠两阶段转移过程

3.3.5 胰酶在两阶段微载体转移中的作用

3.3.6 Vero 细胞珠到珠转移后对流感病毒的增殖

3.3.7 微载体取样方法

3.3.8 微载体细胞计数

3.3.9 微载体显微观察

3.4 结果与分析讨论

3.4.1 Vero 细胞珠到珠转移过程中的新载体建桥效率的优化

3.4.2 Vero 细胞的两阶段珠到珠转移过程

3.4.3 胰酶在两阶段微载体转移中的作用

3.4.4 Vero 细胞珠到珠转移后对流感病毒的增殖

3.5 本章小结

第四章 VERO 细胞无血清培养和封闭连续细胞培养生产流感病毒工艺过程模拟

4.1 前言

4.2 实验原料?试剂与仪器

4.3 实验方法

4.3.1 EX-CELL TM Vero 无血清培养基的配制

4.3.2 Vero 细胞对EX-CELL TM Vero 无血清培养基直接适应和建立细胞库

4.3.3 不同微载体对Vero 细胞吸附的影响

4.3.4 不同搅拌方式对Vero 细胞吸附的影响

4.3.5 CaC12对Vero 细胞吸附的影响

4.3.6 Vero 细胞无血清微载体培养和流感病毒生产

4.3.7 Vero 细胞无血清培养基培养后不换液直接进行病毒生产

4.3.8 多次间歇式珠到珠转移过程培养细胞生产流感病毒

4.3.9 葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的测定

4.4 实验结果与分析讨论

4.4.1 不同微载体对Vero 细胞吸附的影响

4.4.2 不同搅拌方式对Vero 细胞吸附的影响

4.4.3 CaC12对Vero 细胞吸附的影响

4.4.4 Vero 细胞无血清微载体培养生产流感病毒及代谢分析

4.4.5 无血清培养Vero 细胞不换液进行病毒感染过程分析

4.4.6 细胞珠到珠转移后生产流感病毒的多循环间歇操作

4.5 本章小结

第五章封闭连续式细胞培养生产流感病毒工艺过程的设计及其数学模型分析

5.1 前言

5.2 系统流程示意图

5.3 系统的操作

5.3.1 系统准备

5.3.2 细胞的接种和灌注培养

5.3.3 病毒的初级增殖和细胞的放大培养

5.3.4 细胞的连续培养和病毒的连续增殖

5.4 模型假设

5.5 连续培养过程时系统物料平衡分析

5.5.1 细胞培养反应器中的物料平衡分析

5.5.2 病毒增殖反应器中的物料平衡分析

5.6 本章小结

全文总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文及申请的专利

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