以多巴胺为配基研究蛋白质相互作用的色谱方法

论文摘要

细胞中的蛋白质参与和调控着生物体的各种生理活动,其中,大多数蛋白质是通过与配体分子结合或者是作为一个大的生物复合体的一部分来参与细胞生命活动的。因此,研究并阐明蛋白质间相互作用对于理解细胞代谢过程具有重大意义。在实验室前期研究的基础上,本论文继续探索研究蛋白质间相互作用的方法:基于底物与酶的相互作用,以琼脂糖凝胶为载体、乙二胺和戊二醛为间隔臂,固定化多巴胺小分子,吸附以单胺氧化酶B为主的猪肝细胞蛋白质,对单胺氧化酶B与其相关蛋白质间的相互作用进行初步研究。实验结果表明:(1)通过优化层析材料的配基密度,发现提高多巴胺密度可以增加单胺氧化酶B的吸附量,但其他蛋白量也随之增多,影响单胺氧化酶B纯度。从获得较高的酶比活和酶蛋白纯度的角度出发,配基密度约为36μmol/mL gel的多巴胺层析材料吸附单胺氧化酶B效果比较理想,其洗脱液的酶比活为3723 U/mg,Bandscan软件分析酶蛋白纯度为76%。(2)在采用AKTA凝胶层析对多巴胺层析材料洗脱蛋白进一步分离纯化的过程中,发现单胺氧化酶B(相对分子量约60 KDa)与一个相对分子量约为100 KDa的蛋白质无法完全分离。在进样样品中加入牛血清白蛋白作为参照后,凝胶电泳结果证实单胺氧化酶B与Mr100 KDa蛋白之间存在相互作用。(3)研究比较单胺氧化酶B、猪肝细胞胞质液以及二者混合溶液的酶活性后,发现混合溶液中单胺氧化酶B的酶活性提高了约11倍,初步说明细胞胞质液中含有能够与单胺氧化酶B发生相互作用、促进酶催化活性的物质。以上研究结果表明:利用固定化多巴胺小分子吸附以单胺氧化酶B为主的猪肝细胞蛋白质,再研究单胺氧化酶B与其相关蛋白间相互作用的方法可行,可作为研究蛋白质间相互作用的色谱方法用于功能蛋白质组学的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 蛋白质相互作用的研究方法
• 1.2.1 基于生物化学、微生物学、分子生物学、生物物理学的经典研究方法
• 1.2.2 蛋白质相互作用研究方法的新进展
• 1.3 多巴胺与单胺氧化酶 B
• 1.4 本论文的选题思想
• 2 定性定量方法
• 2.1 引言
• 2.2 仪器与试剂
• 2.2.1 实验试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 蛋白质的定量方法
• 2.3.2 蛋白质 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）
• 2.3.3 单胺氧化酶B的活性检测
• 2.3.4 层析材料配基密度的测定方法
• 3 多巴胺层析材料分离纯化单胺氧化酶 B的研究
• 3.1 引言
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 实验试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 猪肝细胞裂解液的制备
• 3.3.2 固定化苯胺与多巴胺对单胺氧化酶B分离纯化的影响
• 3.3.3 固定化多巴胺密度对单胺氧化酶B分离纯化的影响
• 3.3.4 固定化多巴胺层析材料吸附蛋白的盐梯度洗脱的研究
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 固定化苯胺与多巴胺对单胺氧化酶B分离纯化的影响
• 3.4.2 固定化多巴胺密度对单胺氧化酶B分离纯化的影响
• 3.4.3 固定化多巴胺层析材料吸附蛋白的盐梯度洗脱的研究
• 3.5 小结
• 4 单胺氧化酶B相互作用蛋白的研究
• 4.1 引言
• 4.2 仪器与试剂
• 4.2.1 实验试剂
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 样品的制备与预处理
• 4.3.2 AKTA凝胶层析分离纯化单胺氧化酶B
• 4.3.3 AKTA凝胶层析分离纯化单胺氧化酶B操作条件的优化
• 4.3.4 与单胺氧化酶 B存在相互作用的蛋白的研究
• 4.3.5 破坏蛋白质间相互作用的研究
• 4.3.6 细胞胞质液蛋白与单胺氧化酶B相互作用的初步研究
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 AKTA凝胶层析分离纯化单胺氧化酶B
• 4.4.2 AKTA凝胶层析分离纯化单胺氧化酶 B操作条件的优化
• 4.4.3 与单胺氧化酶 B存在相互作用的蛋白的研究
• 4.4.4 破坏蛋白质间相互作用的研究
• 4.4.5 细胞胞质液蛋白与单胺氧化酶B相互作用的初步研究
• 4.5 小结
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 特色与创新
• 5.3 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢