云南特有食药用菌活性多糖研究

论文摘要

本文以云南特有食药用菌天麻[Gastrodia elata Blume]、野生羊肚菌[Morchellaesculenta（L.）Pers.]子实体为原料,利用多糖分离纯化技术、现代医学分析技术、降血脂功能食品的评价及检测方法和仪器分析技术对两种食药用菌活性多糖进行了系统研究,主要获得如下结果:（1）通过对天麻和羊肚菌多糖分离提取的工艺条件研究发现,天麻粗多糖提取的最佳工艺条件为:温度50℃、浸提时间3h、水料比10:1、乙醇浓度80%,在该条件下水提天麻粗多糖得率约为9.67%（干重）。羊肚菌粗多糖提取的最佳工艺条件:为浸提温度85℃、浸提时间2h、水料比50:1、乙醇浓度80%,在该条件下羊肚菌粗多糖得率约为4.96%（干重）。（2）通过对天麻和羊肚菌多糖分离纯化的系统研究发现,两种食药用菌多糖分别经水浸提、减压浓缩、Sevag法脱蛋白、透析、乙醇沉淀、DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100柱层析等一系列分离纯化过程,分别得到天麻多糖组分PGEB-3-H和羊肚菌多糖组分PMEP-1,经高效液相色谱（HPLC）鉴定为均一多糖,其得率分别为0.824%（干重）和1.58%（干重）。经凝胶层析测定,天麻多糖（PGEB-3-H）和羊肚菌多糖（PMEP-1）的相对分子质量分别为28 800和43 600。经过理化性质鉴定分析发现两种菌类食物活性多糖中都不含游离单糖、糖醛酸、蛋白质、多酚类物质等,均为非淀粉类中性纯粹多糖。（3）首次利用多糖化学结构分析的化学方法（单糖组成分析、甲基化分析、高碘酸氧化、Smith降解等）和现代仪器分析方法(气相色谱、红外光谱、GC-MS、1H和13C核磁共振等)对天麻多糖（PEGB-3-H）和羊肚菌多糖（PMEP-1）进行全面结构特征分析,结果发现天麻多糖（PEGB-3-H）是α-1,4-连接为主链有少量α-1,6-连接分支的吡喃葡聚糖。羊肚菌多糖（PMEP-1）是以α-1,4-葡萄糖残基、α-1,6-半乳糖残基、α-1,2-甘露糖残基及α-1,5-阿拉伯糖残基为主要连接,同时含有α-1,2,6-甘露糖分支、α-1,4,6-葡萄糖分支和β-1,2,6-半乳糖分支的高度分支杂多糖。（4）通过选用与血脂代谢及肥胖、肿瘤细胞增殖相关的PPARs和A549模型对天麻多糖（PGEB-3-H）及羊肚菌多糖（PMEP-1）的生物活性进行高通量药物筛选（High-Throughput Screening,HTS）,结果发现PGEB-3-H和PMEP-1对PPARδ模型有一定的激活作用,但作用很弱,效果不显著;对PPARα模型没有激活作用;可见,两种多糖具有一定的生物活性,但比对照阳性药物（2-Bro:2-溴十六烷酸;WY:WY14643）的活性要弱得多。两种多糖在体外对肿瘤细胞A549均无明显的抑制作用。（5）对天麻多糖（PGEB-3-H）和羊肚菌多糖（PMEP-1）降血脂的功能进行动物实验。结果发现,所用的高脂饲料在实验周期内能使大鼠血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）显著升高（P＜0.05）,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）显著下降（P＜0.05）。两种多糖的各试验组(低剂量100mg·kg-1·d-1、中剂量200mg·kg-1·d-1、高剂量400mg·kg-1·d-1)大鼠血清中TG显著地低于高脂模型组（P＜0.05）。两种多糖对TG影响具有明显的剂量效应关系,剂量越高,TG降低幅度越大。在饲用高脂饲料的同时,给予高、中剂量PGEB-3-H和高剂量PMEP-1能使大鼠血清TG维持在正常水平,能达到与正常对照组无明显差异（P＞0.05）的水平。在各实验组中,只有低剂量PGEB-3-H组大鼠血清中TC明显低于高脂对照组,但仍然显著地高于正常对照组:只有低、中剂量PMEP-1组大鼠血清中LDL-C明显低于高脂对照组,但仍然显著地高于正常对照组;只有中剂量PGEB-3-H组大鼠血清中HDL-C明显高于高脂对照组,且与正常对照组无明显差异。PMEP-1三个实验组大鼠血清中HDL-C虽然不是显著地高于高脂对照组,但已达到与正常对照组无显著差异的水平。由此可见,实验用两种多糖对大鼠高脂血症的预防主要是通过对TG的影响实现的,两种多糖对预防高脂血症的形成有积极意义。（6）对天麻多糖（PGEB-3-H）改善学习记忆力的功能进行了研究。Morris水迷宫测试结果显示,东莨菪碱记忆损伤模型组（MC）小鼠找到平台的时间显著长于生理盐水组（NC）和阳性对照组（PC）。PGEB-3-H三个剂量组在大多数训练测试中,小鼠找到找到平台的时间短于MC组,且高剂量组与模型组之间的差异达到了显著水平（P＜0.05,P＜0.01）。由多糖对小鼠脑内乙酰胆碱（Ach）含量影响发现,高剂量PGEB-3-H组小鼠脑内乙酰胆碱（Ach）含量明显高于生理盐水组和阳性对照组(20 g·kg-1·d-1天麻全粉),而中、低剂量组与生理盐水组之间无明显差异（P＞0.05）。可见,天麻多糖（PGEB-3-H）对改善记忆能力有一定的作用,其作用机理可能是通过提高脑内乙酰胆碱（Ach）含量。本论文的创新之处在于:（1）利用云南产天麻和野生羊肚菌为原料,以开发现代保健食品为目的,成功地分离纯化获得了两种活性多糖,并对其理化性质进行了系统研究。（2）采用GC、IR、GC-MS、NMR等先进的化学仪器方法研究了天麻多糖（PGEB-3-H）和羊肚菌多糖（PMEP-1）的一级结构特征,明确地提出两种多糖的结构特征并对天麻多糖的可能重复单元的高级结构进行了模拟计算。（3）尝试运用高通量药物筛选（HTS）技术研究了天麻多糖（PEGB-3-H）和羊肚菌多糖（PMEP-1）的生物活性。（4）首次研究并确证了天麻多糖是天麻改善学习记忆能力的重要活性物质之一,也为天麻益智功能的物质填补了新的内容。（5）研究发现了天麻多糖和羊肚菌多糖具有预防高血脂形成的作用,尤其是对甘油三酯的影响。本文研究方法规范可靠,所得结论完全可以有效地应用于现代保健食品及多糖药物的生产指导中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 图表清单
• 英文缩写表
• 第一章 文献综述
• 0 前言
• 1 食药用真菌活性多糖的概述及分布
• 1.1 活性多糖的概述
• 1.2 食药用真菌活性多糖的来源和分布
• 2 食药用真菌活性多糖的分离纯化及理化性质
• 2.1 食药用真菌活性多糖的分离提取
• 2.1.1 常规的活性多糖提取方法
• 2.1.2 超声波辅助提取法
• 2.1.3 微波辅助提取法
• 2.2 食药用真菌活性多糖的纯化
• 2.2.1 蛋白质的去除
• 2.2.2 色素的去除
• 2.2.3 活性多糖的分级分离
• 2.2.4 活性多糖的纯度鉴定
• 2.3 食药用真菌活性多糖的理化性质研究
• 2.3.1 活性多糖的物理性质研究
• 2.3.2 活性多糖的化学性质研究
• 3 食药用真菌活性多糖的生物学活性
• 3.1 增强机体免疫功能
• 3.2 抗肿瘤作用
• 3.3 抗病毒作用
• 3.4 降血糖作用
• 3.5 抗氧化作用
• 3.6 降血脂作用
• 3.7 改善学习记忆力作用
• 3.8 其他功能
• 4 食药用真菌活性多糖的结构研究
• 4.1 活性多糖的结构分类
• 4.2 活性多糖的结构分析
• 4.2.1 活性多糖的一级结构的分析
• 4.2.2 活性多糖构象的分析
• 4.3 构效关系的研究
• 5 天麻及其活性成分研究
• 5.1 天麻的生物学特性
• 5.2 天麻的化学成分
• 5.2.1 酚性成分
• 5.2.2 多糖成分
• 5.3 天麻的生理功效
• 5.3.1 抗惊厥作用
• 5.3.2 镇静催眠作用
• 5.3.3 增智健脑、延缓衰老作用
• 5.3.4 抗炎作用
• 5.3.5 免疫功能
• 5.3.6 镇痛作用
• 5.3.7 对心血管的作用
• 5.3.8 其它功能
• 6 羊肚菌及其活性成分的研究
• 6.1 羊肚菌的生物学特性
• 6.2 羊肚菌的化学成分
• 6.3 羊肚菌的生理功效
• 6.3.1 增强免疫功能
• 6.3.2 抗肿瘤功能
• 6.3.3 预防动脉粥样硬化
• 6.3.4 抗衰老作用
• 7 本课题的研究目的、意义和主要内容
• 7.1 本课题的研究意义和目的
• 7.2 本课题研究的主要内容
• 本章参考文献
• 第二章 天麻多糖和羊肚菌多糖分离提取、纯化及理化性质研究
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料、试剂、主要设备
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 多糖分离纯化工艺流程
• 1.2.2 多糖含量的测定
• 1.2.3 多糖得率计算方法
• 1.2.4 多糖提取条件工艺优化
• 1.2.5 多糖的纯化
• 1.2.6 多糖的纯度鉴定
• 1.2.7 多糖理化性质的测定
• 1.2.8 多糖比旋光度测定
• 1.2.9 多糖的相对分子质量测定
• 1.2.10 多糖的紫外光谱扫描测定
• 1.2.11 数据处理方法
• 2 结果与分析
• 2.1 多糖提取的最佳工艺条件
• 2.1.1 天麻多糖提取的最佳工艺条件
• 2.1.2 羊肚菌多糖提取的最佳工艺条件
• 2.2 多糖的纯化
• 2.2.1 多糖的DEAE-52纤维素柱层析
• 2.2.2 多糖的Sephadex G-100柱层析
• 2.3 多糖的纯度鉴定
• 2.3.1 天麻多糖（PGEB-3-H）的纯度鉴定
• 2.3.2 羊肚菌多糖（PMEP-1）的纯度鉴定
• 2.4 多糖的紫外光谱扫描测定
• 2.4.1 天麻多糖（PGEB-3-H）的紫外光谱扫描测定
• 2.4.2 羊肚菌多糖（PMEP-1）的紫外光谱扫描测定
• 2.5 多糖的理化性质
• 3 讨论
• 4 小结
• 本章参考文献
• 第三章 天麻多糖和羊肚菌多糖的结构特征研究
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料、试剂、主要仪器设备
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 试剂制备
• 1.2.2 组成单糖鉴定及摩尔比测定
• 1.2.3 多糖红外光谱测定
• 1.2.4 甲基化反应
• 1.2.5 GC-MS分析
• 1.2.6 高碘酸盐氧化及Smith降解
• 1.2.7 NMR分析
• 1.2.8 多糖高级结构理论计算
• 2 结果与分析
• 2.1 天麻多糖（PGEB-3-H）的结构分析
• 2.1.1 天麻多糖（PGEB-3-H）的单糖组成
• 2.1.2 天麻多糖（PGEB-3-H）的糖链中糖残基间的连接位置及连接顺序分析
• 2.1.3 天麻多糖（PGEB-3-H）的糖链中糖苷键及糖环构型确定
• 2.2 羊肚菌多糖（PMEP-1）的结构分析
• 2.2.1 羊肚菌多糖（PMEP-1）的单糖组成
• 2.2.2 羊肚菌多糖（PMEP-1）的糖链中糖残基间的连接位置及连接顺序分析
• 2.2.3 羊肚菌多糖（PMEP-1）的糖链中糖苷键及糖环构型确定
• 3 讨论
• 4 小结
• 本章参考文献
• 第四章 天麻多糖和羊肚菌多糖生物活性高通量筛选试验
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料、试剂、主要仪器设备
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 PPARs模型的建立
• 1.2.2 样品对模型细胞SMMC-7721的毒性测试（MTS法）
• 1.2.3 A549肿瘤细胞筛选模型的建立
• 1.2.4 高通量药物筛选试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 天麻多糖和羊肚菌多糖对模型细胞SMMC-7721的细胞毒性试验
• 2.2 天麻多糖和羊肚菌多糖对筛选模型PPARs的影响
• 2.3 天麻多糖和羊肚菌多糖对筛选模型A549的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 本章参考文献
• 第五章 天麻多糖和羊肚菌多糖降血脂功能研究
• 0 前言
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物与材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 动物分组与饲养
• 1.2.2 清总胆固醇（TC）含量的测定
• 1.2.3 血清甘油三酯（TG）的测定
• 1.2.4 血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量的测定
• 1.2.5 清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量的测定
• 1.2.6 血清动脉粥样硬化指数（AI）的测定
• 1.2.7 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 多糖对高脂血症大鼠血清总胆固醇（TC）含量的影响
• 2.2 多糖对高脂血症大鼠血清甘油三酯（TG）含量的影响
• 2.3 多糖对高脂血症大鼠血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量的影响
• 2.4 多糖对高脂血症大鼠血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量的影响
• 2.5 多糖对高脂血症大鼠血清动脉粥样硬化指数（AI）的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 本章参考文献
• 第六章 天麻多糖改善学习记忆力的功能研究
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料、试剂与仪器设备
• 1.1.1 实验动物与材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 动物分组
• 1.2.2 Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力
• 1.2.3 组织匀浆的制备
• 1.2.4 脑组织总蛋白质含量测定
• 1.2.5 乙酰胆碱（Ach）含量测定
• 1.2.6 脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量测定
• 1.2.7 数据统计
• 2 结果与分析
• 2.1 天麻多糖对东莨菪碱所致学习记忆损伤小鼠的影响
• 2.2 天麻多糖对小鼠大脑乙酰胆碱（Ach）含量的影响
• 2.3 天麻多糖对小鼠大脑丙二醛（MDA）含量的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 本章参考文献
• 第七章 全文结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 致谢
• 攻读博士学位期间（已、待）发表论文及科研情况