鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究

论文摘要

家禽常被用作发育生物学研究的动物模型，很多研究致力在更深层次揭示家禽发育的机理，尤其是生殖系统的发育，在内源性调节的基础上力图通过外源性调控，以提高家禽的繁殖性能。本实验以艾维因鸡胚为材料，分离了胚胎期原始生殖细胞（PGC），并进行了原代和传代培养及其分化潜能的检测，探讨了多种体细胞对PGC体外增殖的影响，研究了植物性生物活性物质大豆黄酮（DAI）和槲皮素（QUE）对PGC增殖的作用及其胞内信号传导机制。1．鸡胚原始生殖细胞原代和传代培养模型的建立在体视显微镜下用玻璃针分离3.5～4d鸡胚生殖嵴，用胰蛋白酶+EDTA消化分散组织，以含5％胎牛血清（FCS）的M199培养液进行PGC和体细胞的共培养，从而建立其原代培养模型，然后将PGC传代到饲养层上进行传代培养。结果表明5％FCS在PGC与体细胞原代培养中有较好的促增殖作用，而在传代培养时，添加了5％FCS的培养液和无血清ITS培养液(10μg/ml胰岛素、5μg／ml转铁蛋白和3×10-8mol／L亚硒酸钠的培养液)能较好地维持并促进PGC的存活和细胞集落数的增加（P＜0.05）；碱性磷酸酶（AKP）和过碘酸雪夫氏反应（PAS）及c-kit和SSEA-1免疫细胞化学染色均证实所分离的细胞为PGC；传代的PGC在饲养层上培养60h后增殖细胞核抗原（PCNA）染色呈强阳性，提示培养的PGC具有较强的增殖活性。体外分化实验表明PGC在去除饲养层和生长因子的情况下能分化成多种细胞，根据其形态可分为神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞。经神经元特异性烯醇化酶（NSE）和角蛋白免疫细胞化学鉴定，证实了神经元样和上皮样细胞的免疫学特征，表明培养的PGC具有分化的多能性。上述结果表明经PGC-体细胞原代共培养后再传代于饲养层上进行传代培养的模型可以用作PGC增殖活性和分化潜能的研究。2．体细胞对鸡胚原始生殖细胞增殖的调控作用为了探讨鸡胚PGC生长的理想支持体系，实验采用三种来源于鸡不同的体细胞（成纤维细胞、骨骼肌细胞和鸡小黄卵泡颗粒细胞）制备饲养层，比较三种体细胞对PGC生长和增殖的影响。同时在三种体细胞饲养层上添加FCS、生长因子及白血病抑制因子（LIF），比较不同生长因子或细胞因子对PGC生长和增殖的影响。另外，用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入显示细胞的增殖活性。部分PGC作传代培养，并添加FCS、LIF和人参皂甙（GS）以研究其对PGC传代增殖的影响。结果表明成纤维细胞饲养层和卵泡颗粒细胞饲养层对鸡胚PGC的存活和增殖效果较骨骼肌饲养层好，PGC数目明显多于后者（P＜0.05），且BrdU标记染色表明成纤维细胞要优于颗粒细胞；生长因子和细胞因子的比较发现，在三种饲养层上，0.5％FCS+LIF（10ng／ml）组效果最好，其次是ITS组和FCS组。而单独添加LIF组的效果较差，尤其在颗粒细胞上表现更明显（P＜0.05）。传代培养发现，5～6d后PGC大量增殖，特别是添加了GS（10μg/ml）后形成更大的细胞团，效果更为明显。结果提示：鸡胚PGC在鸡胚成纤维饲养层上培养效果较好，是鸡胚PGC较理想的支持体系；且添加低浓度血清和LIF及抗氧化性营养素GS对PGC的增殖有明显的促进作用。3．蛋白激酶A和C系统对鸡胚PGC增殖的调控机制利用PGC培养模型探讨了蛋白激酶A（PKA）和C（PKC）信号系统在PGC增殖中的作用。传代培养时，培养液中分别添加腺苷酸环化酶激活剂福司克林（FRSK）和佛波酯（PMA）以分别活化PKA和PKC，并与相应的抑制剂H89和H7联合处理PGC；用BrdU标记细胞的增殖情况。实验结果表明FRSK(10-7～10-5M)刺激鸡胚PGC的增殖（P＜0.05），这种效应可被H89(10-5M)所抑制（P＜0.05）；PMA(10-8M)也能显著促进PGC的增殖，其促增殖作用可被H7(10-7～10-5M)所抑制（P＜0.05）。BrdU免疫细胞化学法检测表明FRSK及PMA处理后细胞BrdU标记指数明显增高，说明PGC具有较强的增殖活性，从而证明了PKA和PKC信号通路在鸡胚PGC的增殖过程中起着重要的调控作用。4．类黄酮对鸡胚PGC增殖的调控及其机制的研究利用PGC传代培养模型研究两种类黄酮DAI和QUE对鸡胚PGC增殖的影响，并探讨了其作用机制。结果表明，DAI（1μg／ml）和QUE（0.01～1μg／ml）显著促进PGC的增殖（P＜0.05）；到10μg／ml时二者对细胞发生毒性作用。利用次黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶（HX／XO）系统产生自由基，发现HX／XO系统对PGC造成严重的氧化损伤作用，PGC数目明显减少（P＜0.05）。DAI或QUE能抑制HX／XO的氧化损伤作用，且两种氧化指标SOD或GSH水平的检测也表明DAI和QUE能显著减缓由HX／XO系统造成的氧化破坏作用。实验还表明DAI和QUE可通过PKA信号转导途径影响PGC增殖。DAI和QUE（1μg／ml）分别与10-5M的H89联合作用后，H89可显著抑制PGC的增殖（P＜0.05）。BrdU标记指数也证实了DAI和QUE的作用。另外，实验还证实DAI和QUE并非通过雌激素样效应作用于PGC。结果提示DAI和QUE通过抗氧化和PKA信号转导两种方式促进PGC的增殖。以上实验结果表明：从鸡胚生殖嵴分离的PGC与体细胞原代共培养，再传代于鸡胚成纤维细胞饲养层上所建立的传代PGC培养模型可用于PGC增殖和分化调控的研究，经AKP、PAS及c-kit和SSEA-1免疫细胞化学染色等多种方法证实了PGC的原始性和体外分化的多能性。在此模型上发现PKA和PKC信号通路介导了PGC的增殖作用，植物性抗氧化剂DAI利QUE可通过抗氧化途径和PKA信号转导途径促进PGC的增殖。在PGC培养模型基础上探索更多外源性物质包括各种营养素对PGC增殖和分化的作用及其机理，同时可利用一些植物活性物质去改变胞内信号通路而促进PGC的体外增殖，将为提高家禽繁殖性能的营养调控、制备嵌合体和转基因家禽提供理论指导和实验平台。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 第一节 禽类原始生殖细胞的发生和迁移
• 1.1 禽类原始生殖细胞的起源
• 1.2 禽类原始生殖细胞的迁移及其分子机制
• 1.3 禽类原始生殖细胞迁移的调控机理
• 1.4 小结
• 第二节 禽类原始生殖细胞的生物学特性
• 2.1 禽类原始生殖细胞的形态学特征及超微结构
• 2.2 原始生殖细胞增殖的内源性调控因素
• 2.3 外源性植物活性物质对原始生殖细胞的增殖调控
• 2.4 原始生殖细胞增殖的信号转导机理
• 2.5 原始生殖细胞分化的潜能
• 2.6 小结
• 第三节 禽类原始生殖细胞的应用
• 3.1 原始生殖细胞作为生殖细胞发育分化的体外模型
• 3.2 原始生殖细胞在制备性腺嵌合体中的应用
• 3.3 始生殖细胞在种质资源保护中的应用
• 3.4 原始生殖细胞作为转基因的有效载体
• 3.5 小结
• 第四节 本研究的目的和内容
• 4.1 研究的目的及意义
• 4.2 研究目标和内容
• 第二章 鸡胚原始生殖细胞原代和传代培养模型的建立
• 第一节 原始生殖细胞原代和传代培养模型的建立
• 1.1 引言
• 1.2 材料方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二节 鸡胚原始生殖细胞体外分化的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 体细胞对鸡胚原始生殖细胞增殖的调控作用
• 1 引言
• 2 材料方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 蛋白激酶A和C系统对鸡胚原始生殖细胞增殖的调控机制
• 1 引言
• 2 材料方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第五章 类黄酮对鸡胚原始生殖细胞增殖的调控及其机制的研究
• 第一节 类黄酮对鸡胚原始生殖细胞的抗氧化作用
• 1.1 引言
• 1.2 材料方法
• 1.3 结果
• 第二节 大豆黄酮和槲皮素对原始生殖细胞促增殖作用的信号转导机制
• 2.1 引言
• 2.2 材料方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 结论和创新点
• 参考文献
• 读博士期间发表及待发表的文章
• 致谢