构巢曲霉几丁质脱乙酰酶基因克隆及表达研究

论文摘要

几丁质脱乙酰酶催化水解几丁质的N-乙酰基生成壳聚糖。壳聚糖已经被广泛应用于各个领域,例如,生物医学、食品添加剂、化妆品、药品等领域。用几丁质脱乙酰酶将几丁质转化为壳聚糖与传统的化学法相比,生产过程可控,可以用来生产新型的、性质优良的壳聚糖低聚物和聚合体。本实验成功从构巢曲霉（Aspergillus nidulans）AF97026中克隆出2条几丁质脱乙酰酶基因的DNA和cDNA序列。an1852的DNA和cDNA序列大小分别为906bp和750bp,编码249个氨基酸,理论分子量为27.5kDa,理论等电点为4.84。an1852包含3个外显子和2个内含子,外显子大小分别为338bp,365bp和47bp,内含子大小分别为86bp和70bp。外显子和内含子的切割点符合GT/AG规则。an9380的DNA和cDNA序列大小分别为843bp和714bp,编码237个氨基酸,理论分子量为26kDa,理论等电点为4.6。an9380包含3个外显子和2个内含子,外显子大小分别为293bp,368bp和53bp,内含子大小分别为71bp和58bp。外显子和内含子的切割点符合GT/AG规则。信号肽预测表明AN1852和AN9380的N端分别存在由28个和18个氨基酸编码的信号肽,说明它们均为胞外酶。进化分析表明,在选定的真菌中,几丁质脱乙酰酶的聚类分析情况与经典分类法相符合。将2个几丁质脱乙酰酶基因的cDNA片段构建到带有高效启动子的穿梭质粒pYES2上,得到2个CDA基因的表达载体。将以上2个表达载体转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1细胞中,通过酿酒酵母菌落PCR和双酶切鉴定,证实了转化的成功,得到了带有an1852和an9380片段的酿酒酵母（S. cerevisiae）INVSc1转化子。通过Northern杂交检测目的基因在酵母中的表达情况,结果显示an1852在半乳糖启动子的调控下成功表达。对转化子AN1852进行酶活检测发现,转化子培养至36小时酶活达到高峰,最高酶活为0.0035U/mL,且酶活变化情况与mRNA的表达规律相一致。鉴于构巢曲霉的几丁质脱乙酰酶具有诸多优良特性,其基因克隆及高效表达的成功,将为今后CDA作用机制的进一步研究及CDA的利用奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题研究背景及意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 几丁质与壳聚糖
• 1.2.2 壳聚糖的应用
• 1.2.3 产几丁质脱乙酰酶的微生物
• 1.2.4 CDA的酶学特性
• 1.2.5 CDA的作用机制
• 1.2.6 CDA基因的克隆和表达
• 1.2.7 CDA的生物学作用
• 1.2.8 利用微生物培养法制备壳聚糖
• 1.3 课题来源及主要研究内容
• 1.3.1 课题来源
• 1.3.2 主要研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 酶与试剂
• 2.1.4 所用软件
• 2.1.5 引物设计
• 2.1.6 常用贮液
• 2.1.7 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 几丁质脱乙酰酶的基因克隆
• 2.2.2 测序结果的生物信息学分析
• 2.2.3 表达质粒 pYES2-cda 的构建及酿酒酵母转化
• 2.2.4 转化子分子检测
• 2.2.5 转化子的活性检测
• 第3章 构巢曲霉几丁质脱乙酰酶基因克隆和序列分析
• 3.1 构巢曲霉几丁质脱乙酰酶基因（cda）克隆
• 3.1.1 构巢曲霉含几丁质脱乙酰酶基因保守区DNA序列的搜索
• 3.1.2 构巢曲霉基因组DNA和RNA的提取
• 3.1.3 构巢曲霉含几丁质脱乙酰酶基因保守区DNA序列的克隆
• 3.1.4 构巢曲霉cda cDNA的克隆
• 3.1.5 克隆片段的测序及序列分析
• 3.2 测序结果的序列分析
• 3.2.1 an1852 的序列分析
• 3.2.2 an9380 的序列分析
• 3.2.3 几丁质脱乙酰酶氨基酸序列相似性分析
• 3.2.4 系统进化分析
• 3.3 本章小结
• 第4章 酿酒酵母转化及其表达研究
• 4.1 酿酒酵母转化
• 4.1.1 酿酒酵母表达载体的构建
• 4.1.2 酿酒酵母转化及转化子鉴定
• 4.2 酿酒酵母转化子分子检测
• 4.2.1 酵母总RNA的提取
• 4.2.2 杂交探针制备
• 4.2.3 an1852 Northern 杂交的
• 4.3 酿酒酵母转化子的酶活检测
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢