雌激素对星形胶质细胞缺氧、缺糖损伤的影响及其机制的探讨

论文摘要

目的研究17-β雌二醇对大鼠大脑皮层星形胶质细胞（AS）缺氧、缺糖损伤的影响,并对其可能的机制进行初步探讨。方法原代培养Sprague-Dawley大鼠大脑皮层AS,建立缺氧、缺糖损伤模型,以吉姆萨染色观察细胞形态学变化;以透射电镜观察细胞超微结构尤其是凋亡小体的变化;以四甲基偶氮唑盐（MTT）还原实验检测细胞活力;以乳酸脱氢酶（LDH）漏出率作为细胞损伤指标;以流式细胞术检测细胞凋亡率,研究氧糖剥夺（OGD）对AS的影响。在此基础上,通过钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM负载细胞,荧光双波长分光光度计检测细胞内钙离子浓度的变化;以黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法检测细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量的变化;免疫细胞化学染色和RT-PCR方法观测凋亡相关分子Caspase-3和Caspase-12在OGD前后的变化。结果①17-β雌二醇增强细胞活力的效应10nmol/L开始出现,在20nmol/L达到最高峰;降低LDH漏出率和抗凋亡效应均从1nmol/L开始,也是在20nmol/L达到最高峰。②缺氧缺糖处理即刻、缺氧缺糖处理前6h、12h、24h、36h,加入终浓度为20nmol/L的17-β雌二醇,均使缺氧缺糖损伤AS细胞活力增高,LDH漏出率降低,细胞凋亡率降低。其中缺氧缺糖处理前24h加入17-β雌二醇在上述5个时间点中,增强细胞活力的效应最强。③缺氧缺糖损伤可使细胞内游离钙离子浓度显著增高,17-β雌二醇预处理后可明显降低钙离子浓度,调节钙稳态失衡。④缺氧缺糖损伤可致AS内SOD活性降低,MDA含量升高,17-β雌二醇预处理后可显著升高SOD活性,降低MDA的含量。⑤RT-PCR和免疫细胞化学染色结果显示,缺氧缺糖可使AS内凋亡相关分子Caspase-3、Caspase-12的表达增加,17-β雌二醇预处理后可显著抑制两者的表达。结论①17-β雌二醇对体外培养AS缺氧、缺糖损伤具有直接的保护作用,并呈一定的量效、时效关系。②17-β雌二醇可能通过调节钙离子浓度、Caspase-3和Caspase-12的表达对缺氧、缺糖损伤AS发挥保护作用。③17-β雌二醇对缺氧、缺糖损伤皮层AS的保护作用可能与提高SOD活性或降低其消耗率,从而抑制缺氧、复氧过程中大量生成的氧自由基对DNA和细胞器膜等的损伤有关;可能与降低脂质过氧化反应有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 正文
• 前言
• 一 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 鼠脑AS的分离培养
• 1.2.2 AS鉴定-GFAP免疫细胞化学染色（SABC法）
• 1.2.3 AS缺氧、缺糖损伤模型的建立
• 1.2.4 实验分组
• 1.2.5 吉姆萨染色观察细胞形态学变化
• 1.2.6 MTT比色法测AS活力
• 1.2.7 LDH漏出率的测定
• 1.2.8 流式细胞术测凋亡
• 1.2.9 透射电镜
• 1.2.10 细胞内游离钙离子浓度的测定
• 1.2.11 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 1.2.12 丙二醛（MDA）的测定
• 1.2.13 Caspase-3、Caspase-12的免疫细胞化学染色（SABC法）
• 1.2.14 引物设计
• 1.2.15 总RNA的提取
• 1.2.16 RNA质量检测
• 1.2.17 RT-PCR
• 1.2.18 琼脂糖凝胶电泳及定量分析
• 1.2.19 统计学处理
• 二 结果
• 2.1 AS鉴定—GFAP免疫细胞化学染色
• 2.2 吉姆萨染色细胞形态学观察
• 2.3 17-β雌二醇对缺氧缺糖损伤AS的影响
• 2）对缺氧缺糖损伤AS的影响'>2.3.1 不同浓度的17-β雌二醇（17-β E₂）对缺氧缺糖损伤AS的影响
• 2.3.2 不同时间点加入17-β雌二醇对缺氧缺糖损伤AS的影响
• 2.4 17-β雌二醇对缺氧缺糖损伤AS超微结构的影响
• 2.5 17-β雌二醇对缺氧缺糖损伤AS细胞内SOD活性和MDA的影响
• 2.6 17-β雌二醇对缺氧缺糖损伤AS细胞内钙离子浓度的影响
• 2.7 17-β雌二醇对缺氧缺糖损伤AS凋亡相关分子的影响
• 2.7.1 17-β雌二醇对Gaspase-12、Caspase-3 mRNA水平的影响
• 2.8 免疫细胞化学染色显示Cleaved Caspase-3、Caspase-12在AS内的表达变化
• 三 讨论
• 3.1 关于体外模拟AS缺血损伤模型
• 3.2 雌激素对缺氧、缺糖损伤AS的影响
• 3.3 雌激素对缺氧、缺糖损伤AS的保护机制
• 四 结论
• 五 附图
• 参考文献
• 综述
• 雌激素在脑缺血中的作用
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文