转基因生物产品PCR检测体系建立

论文摘要

近年来,随着基因工程技术的迅速发展,转基因技术也日趋成熟,商品化生产的转基因生物产品也就越来越多,由此引发的转基因生物安全问题也引起了人们的广泛关注,各国政府纷纷制定相关政策法规,加强转基因生物及其产品的安全管理,截至2002年底,全球已有40多个国家和地区对转基因产品实行自愿标识或强制性标识管理制度。这些法规的实施的前提就是要建立一套稳定、准确的转基因检测技术。目前,转基因生物产品的检测技术主要以PCR技术为基础,并衍生出竞争定量PCR、实时荧光定量PCR技术等。PCR技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确、重复性好等优点被各国检测工作者使用。本研究主要以转基因标准品为材料,分别采取定性PCR、竞争定量PCR、荧光定量PCR技术,对转基因产品进行检测研究,主要研究结果如下:1.通过查阅有关文献及网站、数据库,初步明确了现有各种转基因作物的外源基因信息,收集了国内外商品化的转基因作物19种,其中8种从欧洲转基因标准品库（Fluka公司:Fluka,Buchs,Switzerland）购进,为转基因生物产品检测工作的标准化和与国际接轨奠定了基础。2.为提高检测效率,以转基因大豆标准品为材料,检测了转入的外源基因元件,优化了PCR检测体系,建立了高通量PCR检测方法。3.为提高检测的灵敏度,对引进的转基因玉米标准品分别检测了Bt11、TC1507、Bt176、MON863、MON810、GA21、CBH-351等7个品系的转化事件和相应的外源基因元件,其中5品系的转化事件和转基因元件检测的灵敏度均达到了0.1%检测低限,居现有检测技术标准的最高水平。4.根据建立的转基因成分PCR检测技术体系,利用转基因抗虫水稻和棉花,以及抗花叶病、抗旱的转基因甘蔗材料,分别建立了稳定的PCR检测体系,为建立相关检测技术标准奠定了基础。5.构建了CaMV35S非同源模板的竞争子,建立转基因大豆35S启动子定量检测体系,实现了普通PCR仪定量检测转基因生物产品成分方法,检测低限达到了1%水平,基本满足了目前转基因检测最低标识的需要。6.以荧光了染料SYBRGreenⅠ代替昂贵的Taqman探针,建立了转基因抗除草剂大豆和TC1507转基因抗虫玉米的荧光PCR的定量检测体系,利用转基因定量标准品建立的线性回归方程,通过已知含量的标准品作为待测样品进行验证,结果完全正确,且两体系的检测灵敏度均达到0.04%,已完全满足国际上对转基因定量检测的需要。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 转基因植物检测的背景和发展概况
• 1.全球转基因植物的发展概况和商业化种植
• 2.转基因植物的安全性评价与管理及转基因产品的标签制
• 2.1 转基因植物的安全性评价
• 2.1.1 转基因生物产品安全性争论的焦点
• 2.1.2 转基因安全评估的原则
• 2.2 转基因生物安全管理和各国对转基因生物产品安全管理的要求
• 2.3 转基因标签制度的实行和管理
• 3.目前转基因检测技术
• 3.1 插入外源基因的检测
• 3.1.1 定性PCR检测
• 3.1.2 定量PCR检测
• 3.1.3 SOUTHERN杂交
• 3.1.4 基因芯片检测方法
• 3.2 外源基因表达产物的检测
• 3.2.1 酶联免疫吸附法
• 3.2.2 试纸条方法
• 3.2.3 WESTERN杂交方法
• 3.3 其他新的检测技术
• 4.目前我国对转基因生物产品的管理方法
• 5.本研究内容与目的及意义
• 第二章 转基因生物产品定性PCR检测体系研究
• 1.材料
• 1.1 试验材料
• 1.2 药品试剂
• 1.3 仪器设备
• 2.方法
• 2.1 我国商业化转基因作物外源基因信息表
• 2.2 常规基因组DNA的提取
• 2.2.1 常见试样的CTAB法提取DNA
• 2.2.2 富含蛋白类试样DNA的提取
• 2.3 DNA浓度和纯度的测定
• 2.4 定性PCR检测的主要参数和引物的选用
• 2.4.1 检测转基因抗草甘膦大豆的引物
• 2.4.2 检测转基因玉米基因元件的引物
• 2.4.3 检测转基因玉米转化事件的引物
• 2.4.4 检测转基因棉花的引物
• 2.4.5 检测转基因水稻的引物
• 2.4.6 检测转基因甘蔗的引物
• 2.5 PCR反应体系与程序及对照设置
• 2.6 PCR扩增产物电泳检测
• 2.7 PCR检测结果判断
• 2.7.1 对照样品结果分析
• 2.7.2 试样结果分析
• 3 结果与分析
• 3.1 不同商品化转基因植物的定性PCR检测
• 3.2 转基因大豆的定性PCR检测
• 3.2.1 外源基因定性PCR检测灵敏度分析
• 3.2.2 转基因大豆的高通量PCR检测
• 3.3 转基因玉米的定性PCR检测
• 3.4 转基因抗虫水稻的定性PCR检测
• 3.5 转基因棉花的定性PCR检测
• 3.6 转基因甘蔗的定性PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 实验环境中污染物的控制
• 4.2 转基因生物PCR定性检测的灵敏度
• 4.3 实验过程中严格设立对照组
• 4.4 转基因生物产品定性PCR检测的技术路线
• 4.5 本研究今后进一步的工作计划
• 4.5.1 与实际相结合,应当继续深入研究转基因食品中定性PCR的检测方法
• 4.5.2 加大转基因生物产品检测的覆盖面
• 4.5.3 建立更加快速、准确、稳定的检测方法
• 第三章 转基因生物产品定量PCR检测体系研究
• 1 材料
• 1.1 转基因标准物质
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 酶及试剂
• 1.4 仪器
• 2 方法
• 2.1 核酸提取
• 2.2 非同源对照模板构建
• 2.2.1 PCR产物与载体的连接
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.3 克隆的筛选
• 2.3 插入片段的序列测定及同源性分析
• 2.4 确定与含1%转基因成分大豆相对应的非同源模板的量
• 2.5 荧光定量基因组DNA模板的准备
• 2.5.1 转基因大豆DNA模板的制备
• 2.5.2 转基因玉米TC1507DNA模板的制备
• 2.6 定量PCR反应体系和引物
• 3 结果与分析
• 3.1 竞争定量PCR的原理
• 3.1.1 非同源对照模板构建
• 3.1.2 插入片段的序列测定及同源性分析
• 3.1.3 确定与含1%转基因成分大豆相对应的非同源模板的量
• 3.1.4 竞争定量PCR的校正
• 3.1.5 构建非同源模板对转基因大豆35S启动子定量检测
• 3.2 荧光定量PCR检测体系建立
• 3.2.1 定量检测标准曲线建立
• 3.2.2 转基因抗草甘膦除草剂大豆（40-3-2）的定量检测
• 3.2.3 转基因抗除草剂玉米TC1507的定量检测
• 3.2.4 检测精密度
• 4 讨论
• 4.1 荧光探针和荧光染料的优缺点
• 4.2 影响定量检测的几个因素
• 4.3 定量检测存在的问题
• 4.4 本研究未来的计划
• 结论
• 参考文献
• 附表
• 致谢