小鹅瘟病毒VP3基因真核表达质粒在小鼠中的免疫效果

论文摘要

小鹅瘟是由鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）引起的雏鹅急性或亚急性败血性传染病,以渗出性肠炎、小肠黏膜表层大片坏死脱落、肠道栓塞为特征性病变,该病主要侵害出壳后4～20日龄的雏鹅和番鸭。自1956年我国学者方定一在江苏扬州首先发现并检出小鹅瘟病毒以来,国内外学者对小鹅瘟病毒展开了一系列的研究。我国养鹅业发展势态好,而小鹅瘟是一种传染速度快、发病率和死亡率可高达90%～100%的疾病,一旦爆发将给养鹅户带来巨大的经济损失。传统疫苗对GPV的预防和控制起到了一定的积极作用,但其自身也存在着不可避免的缺点,如灭活苗存在某些重要抗原表位的丢失,免疫原性差;弱毒苗容易发生毒力返祖,干扰检疫等诸多问题,而应用核酸疫苗则不存在这些问题。同传统的灭活疫苗以及弱毒疫苗比较,核酸疫苗具有以下优点:在机体内稳定表达,免疫时间长;避开了病原微生物,无感染的潜在危险;所需剂量低,只要ng水平即可发挥作用。鹅细小病毒VP3基因是GPV主要保护性抗原基因,其编码的蛋白为病毒核衣壳的主要成分,约占总蛋白含量的80%,且暴露于病毒粒子表面,能诱导机体产生中和作用的抗体。对VP3基因真核表达质粒的免疫效果进行研究,为鹅细小病毒核酸疫苗的研制打下基础。本实验将空载体质粒pVAX I和本实验室已成功构建的、能够高效率转染Vero细胞的重组真核表达质粒pVAX I/VP3,通过碱裂解法进行大量提取。用真核表达质粒pVAX I/VP3、空载体质粒pVAX I和生理盐水分别肌肉注射免疫10只6周龄的BALB/c健康雌性小鼠,共免疫四次。无菌条件下,取出免疫小鼠脾脏,分离淋巴细胞,以淋巴细胞转化试验胞内酶MTT法应用特异性抗原GPV刺激检测T淋巴细胞的增殖程度,以流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞的数量,通过SPSS 11.5版统计软件分析后,pVAX I/VP3实验组、pVAX I对照组和生理盐水对照组三组的结果在T淋巴细胞增殖程度和细胞数量上均未达到统计学的显著水平。由此说明,本实验室构建的重组真核表达质粒pVAX I/VP3诱导小鼠产生细胞免疫能力不强。这一结果与张中洋等报道的研究结果相似,但产生这种结果的原因目前尚不清楚,推测可能与免疫小鼠的生理状况或个体差异及淋巴细胞转化试验影响因素多等有关。分离免疫小鼠的血清,并参照李茂祥老师的方法,采用2.2%NaCl、6%PEG浓缩病毒,Sepharose—4B柱层析,提纯GPV抗原。采用双方阵滴定法确定纯化的GPV抗原的最佳工作浓度为10μg/mL,免疫重组表达质粒pVAX I/VP3的鼠混合血清的最佳工作稀释度为1:600,以此建立检测小鹅瘟特异性抗体的间接ELISA法。应用上述建立的间接ELISA法检测免疫小鼠血清中GPV特异性抗体的水平,通过SPSS 11.5版统计软件分析后pVAX I/VP3免疫组分别与pVAX I对照组和阴性生理盐水对照组这两个组别的GPV特异性抗体水平差异显著,而pVAX I对照组与阴性生理盐水对照组的GPV特异性抗体水平无显著差异。并且小鼠pVAX I/VP3免疫组含有的GPV特异性抗体水平明显高于空载体pVAX I对照组和阴性生理盐水对照组,因此,该重组真核表达质粒pVAX I/VP3能够诱导免疫动物产生明显的体液免疫。本实验室已构建的pVAX I/VP3真核表达质粒可以诱导免疫小鼠产生GPV特异性抗体,虽然并没有产生理想的细胞免疫水平,但可以确定本实验室构建的pVAX I/VP3真核表达质粒能在机体内表达,为小鹅瘟核酸疫苗的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1. 小鹅瘟简介
• 2. 鹅细小病毒的特征
• 3. 鹅细小病毒病
• 4. 核酸疫苗
• 5. 免疫检测的研究进展
• 6. 研究的目的和意义
• 正文
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 4. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介