论文摘要
胃蛋白酶广泛存在于脊椎动物胃液中,是一种能在酸性环境下水解多种蛋白质的蛋白水解酶。胃蛋白酶经济价值高,用途广泛,可作为饲料添加剂,用于提高动物饲料利用率,增强仔猪对疾病的抵抗力,降低腹泻发生率,提高仔猪的成活率,降低环境污染;胃蛋白酶在制革、方便食品、奶、口香糖加工制造等行业也有一定的用处。目前,商业、医药途径获得的胃蛋白酶主要从动物胃组织中提取,受动物脏器资源的限制,胃蛋白酶价格较高;容易残留一些动物自身的蛋白酶类,如一些组织蛋白酶等。而微生物反应器具有效率高效,操作简单,能够降低成本等优点,所以,通过筛选微生物反应器,然后规模化生产胃蛋白酶颇有发展前途。本试验的目的是建立一种有效的毕赤酵母真核表达系统,获得能够表达出具有胃蛋白酶活性的菌株。考虑到胃蛋白酶对表达宿主---毕赤酵母的毒害作用,本研究采用胃蛋白酶的前体物胃蛋白酶原A进行表达。通过RT-PCR法从猪胃组织细胞中克隆含胃蛋白酶原A基因编码区的DNA序列,并将该基因片段连接到表达载体pPICZaA中,从而获得重组子pPICZa A-pep A,经PCR和酶切检测后,用限制性内切酶PmeI对重组子pPICZa A-pep A进行线性化处理,经电转化把线性化的重组子pPICZ a A-pep A,整合到表达宿主X-33染色体上,利用含zeocin的YPDS固体培养基平板对转化子进行抗性水平筛选。通过zeocine抗性水平和实时定量RT-PCR法筛选到4个高mRNA表达胃蛋白酶原A基因的毕赤酵母菌株,通过BMGY摇瓶分别培养这4个阳性转化子,菌液离心后,菌体转入BMMY培养液中进行甲醇诱导表达,每隔24h,添加0.5%的甲醇。用Ni SepHarose High Performance亲和层析柱对发酵上清液进行纯化,SDS-PAGE电泳显示,有一条45kDa左右的亮带,该条带位置与预期目的蛋白大小基本一致。这说明在强启动子--醇氧化酶1(AOXl)的作用下,胃蛋白酶原A在毕赤酵母x-33中成功表达。重组胃蛋白酶活性检测显示:重组所获得蛋白酶原,经过酸化处理后,能够表现出胃蛋白酶的降解蛋白质的性质。
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