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猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达及其抗体制备

2020-11-23阅读(480)

猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达及其抗体制备

论文摘要

E2蛋白是猪瘟病毒的跨膜结构糖蛋白,是最易发生变异的一种蛋白,能诱导感染动物产生保护性免疫和猪瘟病毒中和抗体,是一种免疫优势蛋白,其中A1、B、C区对介导中和抗体的产生很重要,用A1和B或A1和C的单抗可见协同中和反应。表达CSFV Brescia株E2蛋白重组伪狂犬病毒以及用亲和层析法从昆虫细胞中的基因工程E2蛋白均能保护免疫猪抵抗猪瘟病毒的感染,可以确定E2蛋白诱导的免疫反应足以保护免疫猪抵抗猪瘟病毒的感染。为制备猪瘟病毒E2蛋白的抗体,研究E2基因表达产物在免疫检测中的应用及E2蛋白的中和性抗原表位,我们进行了猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达。首先根据GenBank中登录的猪瘟病毒基因组序列,设计一对引物,利用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术从本实验室保存的重组质粒（PGEX-4T-1-PE2）中扩增出大小约为622bp的基因;经单酶切鉴定,与已知的猪瘟病毒E2基因含有相同的DraⅠ酶切位点。PCR产物分离纯化后连接到pMD18-T载体,并转化宿主菌DH5α,经菌液PCR筛选出阳性重组克隆PMD18-T-TE2,结果表明本实验成功的克隆到猪瘟病毒TE2基因。其次,根据所克隆的猪瘟病毒TE2基因序列和原核表达载体PGEX-4T-1多克隆酶切位点设计另一对引物,应用PCR技术从重组质粒PMD18-T-TE2中扩增出长约622bp的猪瘟病毒TE2基因,编码包括CSFV E2囊膜糖蛋白主要抗原区域A、B、C和D。再将扩增的猪瘟病毒TE2基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-1中,经质粒PCR和EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆,构建原核表达重组质粒PGEX-4T-1-TE2。然后将该重组质粒转化大肠杆菌(EcoliRosetta（DE3）BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）表达出谷胱甘肽-S-转移酶（GST）与TE2的融合蛋白GST-TE2,融合蛋白的分子量约为47.0KD,与预期结果相符。通过优化原核表达条件,确定了原核表达的最佳诱导时间和诱导剂浓度。对表达蛋白的可溶性进行鉴定,结果表明表达产物GST-TE2融合蛋白以包涵体形式存在。我们用优化的原核表达条件对含有PGEX-4T-1-TE2质粒的Rosetta（DE3）BL21菌进行大量诱导表达,反复冻融和超声方法裂解诱导菌,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,Folin-酚法测定提取的融合蛋白GST-TE2浓度约为1.2mg/ml。应用提取的GST-TE2融合蛋白作为抗原免疫小鼠制备鼠抗猪瘟病毒TE2多克隆抗体。琼脂扩散实验表明制备的多抗具有良好的反应性,ELISA实验表明鼠多抗的有效稀释度可达1:25600,免疫印记（Western-blotting,WB）实验证实鼠抗猪瘟病毒GST-TE2多抗含有抗GST抗体和抗融合蛋白GST-TE2抗体。综上所述,本研究成功地克隆了猪瘟病毒TE2基因,成功构建了原核表达质粒PGEX-4T-1-TE2并进行了原核表达,提取了融合蛋白GST-TE2,并且制备了效价高、反应性强的鼠源抗猪瘟病毒GST-TE2多克隆抗体,这些为进一步研究猪瘟病毒E2蛋白免疫学功能及其应用提供了试验材料。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 目录
  • 插图和附表清单
  • 常用中英文缩写
  • 文献综述
  • 引言
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验动物
  • 1.2 质粒和菌种
  • 1.3 主要工具酶及试剂
  • 1.4 主要溶液的配制
  • 1.5 实验仪器
  • 1.6 猪瘟病毒TE2基因PCR扩增
  • 1.7 猪瘟病毒TE2基因的克隆
  • 1.8 猪瘟病毒TE2基因的原核表达质粒的构建
  • 1.9 猪瘟病毒TE2基因的原核表达与鉴定
  • 1.10 GST—TE2融合蛋白的大量提取
  • 1.11 GST—TE2融合蛋白的定量
  • 1.12 鼠抗猪瘟病毒TE2多克隆抗体的制备及鉴定
  • 2 结果与分析
  • 2.1 猪瘟病毒TE2基因的克隆与鉴定
  • 2.1.1 PCR扩增目的基因TE2
  • 2.1.2 TE2基因PCR产物的单酶切鉴定
  • 2.1.3 TE2基因的克隆与鉴定
  • 2.2 猪瘟病毒TE2基因的原核表达与鉴定
  • 2.2.1 原核表达重组质粒PGEX-4T-1-TE2的双酶切鉴定
  • 2.2.2 SDS-PAGE检测诱导表达的GST-TE2融合蛋白
  • 2.2.3 GST-TE2融合蛋白的可溶性鉴定
  • 2.3 GST-TE2融合蛋白的提取
  • 2.3.1 PGEX-4T-1-TE2诱导表达的条件优化
  • 2.3.2 GST-TE2融合蛋白的大量提取结果
  • 2.3.3 GST-TE2融合蛋白的浓度测定
  • 2.4 鼠抗猪瘟病毒TE2多克隆抗体的鉴定结果
  • 2.5 Western-blotting检测鼠抗猪瘟病毒TE2多克隆抗体特异性
  • 3 讨论
  • 3.1 PCR产物的克隆与鉴定
  • 3.2 原核表达重组载体的构建及鉴定
  • 3.3 猪瘟病毒TE2基因的原核表达
  • 3.3.1 表达系统的选择
  • 3.3.2 宿主菌的选择
  • 3.3.3 表达载体的选择
  • 3.3.4 猪瘟病毒TE2基因的诱导表达
  • 3.3.5 信号肽序列对TE2基因原核表达的影响
  • 3.3.6 密码子的使用对TE2基因原核表达的影响
  • 3.4 鼠抗猪瘟病毒TE2多克隆抗体的制备
  • 4 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介
  • 在读期间发表的学术论文

    • 相关论文文献

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