TNF-α基因单核苷酸多态性与肺炎的相关性研究

论文摘要

肺炎是包括肺泡和间质组织在内的肺组织感染。肺炎在临床上相当常见,大部分肺炎患者在接受合理抗生素治疗后较快地痊愈出院,但临床上也能见到部分肺炎患者虽然给予足量抗生素,但炎症反应仍不断进展,严重影响呼吸功能,部分患者需气管插管、液体复苏、血管活性药物等治疗,即这部分患者进展为重症肺炎。重症肺炎一般是由于严重的细菌感染所致,因此临床上十分重视针对细菌的抗感染治疗。虽然新的抗生素相继问世,但是重症肺炎发病率和死亡率并没有明显下降。随着基础和临床研究的进一步深入,我们认识到重症肺炎导致的全身炎症反应（SIRS）以及多器官功能障碍综合征（MODS）是机体防御机制过度激活引起自身破坏的结果,而不是细菌及其毒性产物直接作用的结果。因此,国内外学者积极探索对重症肺炎新的治疗方法,如细胞因子、免疫调节、抗氧化剂治疗等。人体的免疫系统是一个复杂的网络系统,有引起炎症反应,促进抵抗外来抗原的,也有抑制炎症反应,避免机体遭受过度炎症反应而引起损伤的。致炎与抗炎两方面存在精确的调控,这是机体赖以保护自身,抵抗病原的基础。在某些情况下,例如在重症肺炎患者体内,致炎/抗炎的平衡被打破,致炎作用增强或抗炎作用减弱,将使机体易于感染或既有感染易于恶化;而在另外一部分患者,尤其自身免疫病或肿瘤患者,致炎作用被抑制,使机体不能敏感地觉察病原的入侵,导致组织被破坏而无明显临床表现。因此,精确的免疫调节极其重要。其中,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在炎症过程中扮演了重要的角色。TNF是一类具有炎症介导与肿瘤细胞毒性作用的细胞因子,由3条相同的多肽链组成,形成有活性的三聚体结构。TNF与靶细胞膜上3个TNF受体同时结合,传递级联信号。TNF有两种存在形态,在合成初期,TNF通过短的跨膜片段与细胞膜相连形成膜蛋白结构,后来经金属蛋白酶降解形成可溶结构。这两种存在形式都有生物活性,因此,局部的细胞之间可以通过膜上TNF桥接来传递信号,也可以通过分泌TNF到细胞外传递炎症信号。几乎所有体细胞均表达TNF受体,但不同细胞接受TNF信号后的表现可以有很大不同,这取决于细胞种类与细胞所处的状态。通常TNF传递抗感染信号,能诱导受病毒感染的细胞凋亡,或者经LPS诱导血细胞生成和释放TNF,促进炎症反应清除病原。在另外一些情况,TNF传递组织重构的信号。例如,表达在血细胞表面的TNF通过直接桥接多个细胞,既可促进淋巴细胞增生,也可促进淋巴细胞凋亡。根据TNF细胞来源和分子结构不同,可分为TNF-α和TNF-β两型。TNF-α主要由活化的单核/巨噬细胞产生:TNF-β则主要由激活的T淋巴细胞产生,但二者结合相同的受体,具有相同的生物学活性。TNF-α的产生一般是LPS等刺激因子与单核/巨噬细胞的特定受体结合,通过一系列信号转导激活转录因子,启动下游TNF基因的转录。TNF-αmRNA转录后,合成TNF-α前体蛋白,并经丝氨酸蛋白酶裂解,形成可溶的TNF-α并释放到细胞外。TNF-α与靶细胞膜表面的TNF受体结合,激活多种信号转导途径,活化大量的细胞基因,产生广泛的生物学作用。在肺部炎症中,TNF-α通过促进中性粒细胞表面细胞黏附分子CD11/18表达及氧自由基释放,介导粒细胞在心肺循环中黏附于肺内毛细血管内皮上,损伤血管内皮。TNF-α能够诱导多种细胞合成和向胞外分泌PLA2,实验证明PLA2能催化膜磷脂生成溶血性磷脂酰胆碱、花生四烯酸、血小板活化因子、白细胞三烯及各种前列腺素等强效致炎因子,进一步加重炎症引起的肺组织损伤。给予单克隆抗体中和肺循环中游离的TNF-α,猪肺内水肿和炎细胞浸润状况有明显改善。应用对TNF-α合成有特异性抑制效应的FR167653后,大鼠肺间质水肿和中性粒细胞浸润明显减轻,动物死亡率也显著下降,提示TNF-α合成的有效抑制剂可减轻脓毒症的肺损伤。在大鼠闭塞性细支气管炎模型中,FR167653通过减弱NF-κB的激活,减少TNF-α的表达,从而保护了气道。因为TNF-α在炎症反应中起着关键作用,所以精确调控TNF-α的表达极其重要。当控制失衡,TNF-α可能导致严重感染性疾病,例如感染性休克。既然TNF-α与炎症密切相关,那么TNF-α基因的突变就是否会影响TNF-α的转录与表达,或者引起严重的肺部感染,甚至发展为脓毒症,增加重症肺炎的发病率与脓毒症的死亡率呢?在TNF-α启动子区离转录起始位点上游308个核甘酸处,一般有1个鸟嘌呤（G）位点,人群中第6号染色体大约80%在这个位点是鸟嘌呤,而在20%的人群以腺苷酸（A）代替了G。因为每个个体有2个拷贝的第6号染色单体,因此,每个个体的基因型可分为GG、GA、AA,其相应的频率大约为68%～80%、15%～25%、2%～5%。由于TNF-α-308A的转录活性高于TNF-α-308G,在接受相同量LPS刺激,携带TNF-α-308A等位基因者的TNF-α产生量较多。Mira的研究表明,带有TNF-α-308A等位基因的人群易罹患脓毒性休克。台湾有研究指出,带有TNF-α-308A等位基因并不代表较高的脓毒性休克发病率,而是当脓毒性休克发生后,TNF-α-308A导致更高的死亡率。国外一项多中心研究探讨了TNF-α-308A与脓毒症的关系,携带TNF-α-308A的脓毒性休克患者有68%出现血浆TNF-α浓度升高,而携带TNF-α-308G的患者有53%出现TNF-α浓度升高,但二者浓度水平无明显差异（48 pg/mL vs.29pg/mL,P=0.31）。然而,TNF-α-308A死亡率明显较TNF-α-308G组高（71.4%VS 42.6%,P=0.008）。通过分析发现,TNF-α-308A将死亡率升高了约3.75倍。在此研究中也检查了其他突变位点,如-238,-244和-376,但未发现与病情相关。Khalil的研究也得出相同的结果,认为TNF-α-308A增加了死亡率。TNF-α基因其他位点也发现与炎症相关,例如TNF-α-857C/T。在包含98例特发性急性前葡萄膜炎与354名志愿者的研究中,70%的患者携带TNF-α-857CC,28%携带TNF-α-857T,85.6%志愿者携带TNF-α-857CC,51%携带TNF-α-857T,等位基因在患者与志愿者间的分布的分布有显著性差异。TNF-α与术后感染也有关系,197名食管癌手术患者中55名出现术后感染,发现TNF-α-308A与感染并发症有关,实验中也发现了-238、-863、-857等位点的突变,但与术后感染并发症无关。虽然在研究人员认为TNF-α-308A与TNF-α的高表达有关,但是也有相关研究认为TNF-α-308A不影响TNF-α的表达,而TNF-α-863A似乎还降低了TNF-α的表达。TNF-α-308G/A与TNF-α-238G/A是否存在突变与AECOPD发生与否无关,而St（u|"）ber对80例脓毒症病人的研究也发现,TNF-α-308A与严重感染的易感性无关联。因此,TNF-α启动子区SNPs是否与严重细菌感染引起的脓毒症的转归有关尚存争论。本研究拟通过PCR-PFLP法及测序检测TNF-α启动子区5个SNPs（TNF-α-1031、-863、-857、-308与-238）在肺炎及健康人群中的分布,通过ELISA方法检测研究对象血浆TNF-α浓度,再结合肺炎患者病情,探讨SNPs与肺炎发病及病情严重程度的相关性,为进一步进行重症肺炎发病机制的研究、重症肺炎的早期干预及重症肺炎预后判断提供理论依据。方法1、收集2006年11月至2007年6月就诊于广州军区广州总医院的67例成年肺炎患者及50例健康体验者,抽取外周血,提取白细胞基因组DNA,根据TNF-α启动子区5个SNPs（TNF-α-1031、-863、-857、-308与-238）设计5对引物,PCR扩增目的片段。2、根据酶切位点选择相应限制性内切酶对PCR产物进行酶切,并根据酶产物长度判断多态性位点的存在。3、选择突变DNA样本重新扩增后进行测序,确定突变位点确定存在。4、分离外周血血清,通过ELISA方法检测TNF-α浓度。5、收集肺炎患者住院天数、血白细胞计数、中性粒细胞计数与死亡率等数据,并分析以上资料与SNPs的关系。结果1、TNF-α启动子基因突变位点的分布在肺炎患者中,除TNF-α-238G外,其余位点均存在突变,其中,TNF-α-1031T/C发现17例杂合子,4例纯合子,TNF-α-863C/A发现11例杂合子,2例纯合子,TNF-α-857C/T发现7例杂合子,1例纯合子,TNF-α-308G/A发现11例杂合子,未发现纯合子。在健康对照组中,TNF-α-1031T/C发现12例杂合子,未发现纯合子,TNF-α-863C/A发现4例杂合子,2例纯合子,TNF-α-857C/T发现4例杂合子,未发现纯合子,TNF-α-308G/A发现3例杂合子,未发现纯合子,TNF-α-238G/A仅发现1例杂合子,与肺炎组比较,其分布无统计学差异。2、TNF-α启动子SNPs与肺炎临床特征的相关性在重症肺炎患者中,除TNF-α-238G外,其余位点均存在突变,其中,TNF-α-863C/A突变在重症肺炎组分布为野生型5例,突变型4例,在非重症肺炎组的分布为野生型49例,突变型9例,其分布具统计学差异（P=0.041）。TNF-α-308G/A的突变在重症肺炎组分布为野生型5例,突变型4例,在非重症肺炎组的分布为野生型51例,突变型7例,其分布具统计学差异（P=0.015）。另外,TNF-α-308G/A突变在死亡病例中的分布为野生型1例,突变型3例,在存活病例中的分布为野生型55例,突变型8例,其分布具统计学差异（P=0.001）。同时,在肺炎患者中,TNF-α-308G/A突变组与野生组相比,外周血白细胞、中性粒细胞计数（9.314±4.327×109/L vs.13.055±4.192×109/L,7.055±4.265×109/L vs.11.102±4.123×109/L）的差别有统计学差异（P=0.005）。3、肺炎组与健康对照组相比,血浆TNF-α浓度较高（71.407±46.728pg/mL Vs.4.642±3.979pg/mL）,具统计学差异（P=0.000）;非重症肺炎组与重症肺炎组相比（69.892±47.027pg/mL vs.81.176±46.267pg/mL）则无统计学差异（P=0.505）。各SNPs突变组与野生型组比较,血浆TNF-α浓度无显著性差异。结论本研究通过PCR-PFLP方法检测67名肺炎患者及50名健康体检者TNF-α启动子区其中5个SNPs（TNF-a-1031、-863、-857、-308、-238）的分布,发现TNF-α238A在中国汉族人群中的分布稀少,单个SNP在肺炎患者与健康人中的分布无差异,与其他研究结果的分布频率相一致。另外,肺炎患者5个SNPs总体的突变率较高。通过ELISA方法检测研究对象血浆TNF-α浓度发现在肺炎组中TNF-α浓度较高,说明TNF-α与感染相关,但以上5个SNPs不影响TNF-α的表达。通过对肺炎患者病情与SNP分布情况的分析发现,携带TNF-α-308A等位基因患者的病情较重,死亡率较高。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 导论
• 第一章 TNF-α基因启动子区5个位点（-1031、-863、-857、-308、-238）在研究对象中的分布
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 结果
• 1.4 小结
• 第二章 血清TNF-α浓度检测
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 小结
• 第三章 TNF-α各SNPs与患者病情严重程度的相关性分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.4 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 中英文缩略语词表
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢