解淀粉芽孢杆菌漆酶基因的克隆与表达

论文摘要

漆酶是一种重要的木质素降解酶,在木质素降解、腐殖质形成过程中发挥重要作用,对与木质素结构相似的许多环境污染物也有明显的降解能力。漆酶在环境保护、造纸工业、食品工业及生物传感器工业等领域有广泛的应用价值,目前已成为研究的热点。漆酶在自然界中主要由白腐菌产生,但白腐菌产漆酶的能力较低,很难适用工业发酵的要求。同真菌漆酶比较,细菌漆酶具有不需糖基化、热力学稳定性好,酶活最适pH广泛等优点。本实验室己从土壤中筛选到的一株产漆酶细菌lac7,并进行了初步的酶活检测与鉴定,但产酶量较低,为克服这一困难,本研究试图从lac7基因组中克隆出编码细菌漆酶的基因,在大肠杆菌表达系统中大量表达,分离纯化获得纯酶并进行初步的酶学分析,为后续细菌漆酶的开发利用创建一个良好的平台。论文共分为四个部分。1.lac7漆酶基因的克隆。以提取的DNA为模板进行pcr,扩增产物经测序与Blast分析,判定为漆酶基因片段。其长度为821bp。2.漆酶高级结构的预测。利用生物信息学的知识对漆酶的高级结构进行预测,然后再分别使用PSIPRED和pymol初步解析了漆酶的二级和三级结构,获得了较为理想的三维立体模式图。3.lac7漆酶基因在大肠杆菌中的表达。将克隆的细菌漆酶基因插入到细菌质粒表达载体pET21b上,转化到细菌宿主细胞BL21（DE3）中进行表达。经一系列诱导表达条件摸索发现使用0.6mmol/LIPTG在30℃诱导4小时表达的效较佳。经Ni2+离子层析柱一步纯化,获得纯净的酶蛋白。SDS-PAGE电泳表明,重组蛋白的相对分子量为30kDa。4.漆酶的酶学性质研究。对该酶的酶学性质研究分析发现,lac7细菌漆酶最适反应温度为37℃,以ABTS为底物测定该酶的最适反应pH为3.0,以DMP为底物时该酶的最适反应pH为8.0。测得该酶在37℃,pH8.0的条件下催化DMP氧化反应Km值为0.624mmol/L, Vmax为0.33μM/ml/min, Kcat为1.32×103s-1在相同温度pH3.0的条件下催化氧化ABTS反应的Km值为6.01mmol/L,Vmax为0.63μM/ml/min, Kcat为7.6×103s-1。该酶具备良好的热稳定性,在80℃条件下处理30分钟仍能保持保持70%以上的活性.

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 漆酶的特性
• 1.1.1 结构特征
• 1.1.2 漆酶的化学组成
• 1.1.3 漆酶的理化性质
• 1.2 漆酶反应机理
• 1.2.1 漆酶作用底物
• 1.2.2 催化反应机理
• 1.3.漆酶基因结构分析
• 1.4 漆酶基因的克隆及表达
• 1.5 大肠杆菌PET 表达系统
• 1.6 细菌漆酶的功能
• 1.7 细菌漆酶的研究现状
• 1.8 漆酶的应用
• 1.8.1 在有机合成方面的应用
• 1.8.2 环境保护
• 1.8.3 食品工业
• 1.8.4 造纸工业
• 1.8.5 生物检测
• 1.8.6 其它方面
• 2 引言
• 3 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和载体
• 3.1.2 试剂和药品
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 仪器设备
• 3.2 流程
• 3.2.1 漆酶基因的克隆
• 3.2.2 漆酶基因在大肠杆菌中的表达和纯化
• 3.3 方法
• 3.3.1 解淀粉芽孢杆菌 lac7 基因组 DNA 的提取
• 3.3.2 漆酶基因的克隆
• 3.3.3 核酸片断的纯化
• 3.3.4 质粒的提取
• 3.3.5 酶切体系
• 3.3.6 重组载体的构建
• 3.3.7 感受态细胞的制备
• 3.3.8 转化
• 3.3.9 阳性转化子的筛选
• 3.3.10 目的基因在大肠杆菌中的表达检测
• 3.3.11 漆酶的高级结构预测
• 3.3.12 表达产物的纯化
• 3.3.13 蛋白含量测定
• 3.3.14 漆酶酶学性质分析
• 4 结果和分析
• 4.1 引物
• 4.2 解淀粉芽孢杆菌漆酶基因的克隆
• 4.2.1 PCR 扩增漆酶基因
• 4.2.2 漆酶基因的 TA 克隆及测序结果
• 4.3 漆酶高级结构预测
• 4.3.1 漆酶二级结构预测
• 4.3.2 漆酶三级结构的预测
• 4.4 漆酶基因的原核表达
• 4.4.1 pET21b-lac 的构建
• 4.4.2 pET21b-lac 表达产物的检测结果
• 4.4.3 诱导表达条件的优化
• 4.5 漆酶蛋白的纯化
• 4.6 漆酶的酶学性质
• 4.6.1 最适反应 pH
• 4.6.2 pH 稳定性
• 4.6.3 最适反应温度
• 4.6.4 温度稳定性
• 4.6.5二价金属离子对酶活的影响
• 4.6.6 漆酶的Km
• 5 结论和讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.3 展望
• 参考文献
• ABSTRACT