论文摘要
舌癌是口腔癌中最常见的恶性肿瘤,约占口腔癌的40%以上,发病率男性约为0.5～0.6/10万,女性约为0.4～0.5/10万。近年来舌癌的发病率呈明显上升趋势,发病低龄化。舌癌的发病因素目前尚不十分清楚,可能与局部创伤、吸烟、嗜酒等因素有关。由于舌体组织是一个肌性活动器官,淋巴及血运丰富,且舌癌多呈浸润性生长,早期容易发生淋巴结转移,预后较差。因此,研究舌癌发生、发展的机理,探索有效的预防及治疗的方法,乃是舌癌防治研究的重要领域。流行病学调查发现,长期服用阿司匹林（Aspirin）和其它非甾体类抗炎药物（Non-steroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs）治疗其他疾病的人群,可明显降低结直肠癌的发病率,降低结肠息肉的大小和数量,并可降低结肠息肉恶变的危险性。进一步研究发现,NSAIDs不但能抑制肠道上皮肿瘤的发生,还具有预防结肠以外上皮癌发生的作用,如食道癌、胃癌和乳腺癌,同时还可以预防前列腺癌、膀胱癌以及头颈部鳞癌的发生。NSAIDs的这种作用主要与抑制环氧化酶-2（Cycloxygenase-2,COX-2）酶的活性有关,因而认为抑制COX-2酶的活性,是预防及治疗恶性肿瘤的热点之一。本课题从病理形态学、细胞生物学、实验动物学的角度,通过免疫组织化学、分子生物学和医学统计学等方法,研究了选择性COX-2抑制剂塞来昔布（Celecoxib）对人舌鳞状细胞癌（Human tongue squamous cell carcinoma,HTSCC）Tca8113细胞的生长抑制及诱导凋亡的作用。首先采用免疫组化的方法研究了人正常口腔粘膜、不典型增生上皮、舌鳞状细胞癌及有、无癌转移的颈部淋巴结组织中COX-2、血管内皮生长因子-C（Vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）的表达及舌癌组织中的微血管密度（Microvessel Density,MVD）,探讨COX-2和VEGF-C蛋白在HTSCC组织中的表达强度与临床诊断及预后分析中的相互关系及意义;运用分子生物学方法观察塞来昔布抑制Tca8113细胞生长及诱导凋亡的作用,研究塞来昔布增强抗癌药物顺铂（Cisplatin,CDDP）及博莱霉素（Bleomycin,BLM）对Tca8113细胞的杀伤作用;建立裸鼠Tca8113细胞皮下移植瘤动物模型,观察塞来昔布与CDDP联合应用后对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,探讨选择性COX-2抑制剂在口腔癌预防及治疗方面的应用价值。一、COX-2和VEGF-C在人舌鳞癌组织中的表达及与颈淋巴结转移的关系目的:通过观察COX-2及VEGF-C在人正常口腔黏膜、不典型增生上皮、舌癌以及有、无癌转移的颈部淋巴结组织中的表达,研究两者与舌癌发生、血管生成及颈部淋巴结转移之间的关系。方法:搜集2000年至2006年间我院病理科保存的46例舌鳞状细胞癌石蜡标本,其中男性26例,女性20例,年龄28～81岁,平均（53.78±11.43）岁。标本经病理学证实,均为高～中分化鳞状细胞癌。46例患者中,伴颈淋巴结转移者13例,所有患者术前均未接受放疗或化疗。另取8例外伤清创保留的口腔粘膜作为正常对照。采用S-P免疫组化染色法,通过半定量方法,研究COX-2和VEGF-C在人正常口腔黏膜、不典型增生上皮、舌鳞癌及颈部淋巴结组织中的表达。根据免疫反应的强度分为（—）、（+）、（++）、（+++）4个等级。根据免疫染色情况,通过计数的方法,计算CD34标记的微血管数量,研究肿瘤组织中微血管密度（MVD）。结果:COX-2在人正常口腔粘膜上皮不表达或弱表达,在增生和不典型增生的鳞状上皮中表达逐渐增强,在大部分舌鳞癌组织及转移淋巴结中高表达。VEGF-C在人正常口腔粘膜及不典型增生鳞状上皮中弱表达,在舌鳞癌组织中表达增强。COX-2及VEGF-C在有、无淋巴结转移的原发灶癌组织中的表达强度之间差异均有显著性意义,发生淋巴结转移组的舌癌原发灶组织中COX-2和VEGF-C的表达强于未发生淋巴结转移组。在46例人舌鳞癌组织中,COX-2和VEGF-C之间的表达强度呈正相关（rs=0.874,P=0.000）。CD34染色表明,人舌鳞癌组织中新生微血管主要分布在在癌组织周围与正常组织之间,舌癌组织中COX-2、VEGF-C表达的强弱同舌癌组织中MVD值均呈正相关（P=0.000）。结论:COX-2与VEGF-C的强阳性表达与舌鳞状细胞癌的生物学行为密切相关,COX-2和/或VEGF-C可以作为临床判断肿瘤的侵袭性、转移潜能及估计预后重要的参考指标,其在肿瘤发生中的作用机制有待于进一步探讨。二、COX-2抑制剂塞来昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞生长抑制及诱导凋亡的作用目的:观察选择性COX-2抑制剂塞莱昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞生长抑制及诱导凋亡的作用。方法:Tca8113细胞常规培养24 h后,分别加入含有不同浓度塞来昔布的培养液,并以塞来昔布敏感细胞人肝癌Hep-G2细胞株作为阳性对照,其药物终浓度分别为2.5、5、10、20、40、80μmol/L。培养24、48、72h后,采用MTT方法测定细胞的OD值,计算细胞生长抑制率;采用倒置显微镜、光学显微镜及透射电镜观察药物处理后的细胞形态学及超微结构变化;采用流式细胞仪检测分析细胞周期变化;应用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学特征;应用Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞早期凋亡的变化。结果:COX-2蛋白在Tca8113细胞呈强阳性表达,塞来昔布在抑制细胞生长的同时,抑制Tca8113细胞COX-2蛋白的表达。塞来昔布主要以剂量依赖方式抑制Tca8113细胞的生长、增殖,当药物浓度达到≥40μmol/L时,这种作用最为明显。塞来昔布抑制Tca8113细胞生长增殖的作用,与阻滞细胞周期进程有关,其主要阻滞Tca8113细胞从G1期细胞向S期细胞进程,导致G0/G1期细胞的数量增加,从（53.53±0.93）%增加至（66.70±0.98）%（40μmol/L,24 h,P=0.000）和（58.77±1.35）%（80μmol/L,24h,P=0.001）,而S期和G2/M期细胞数量相应减少,S期细胞从（35.73±0.76）%减少至（25.97±1.23）%（40μmol/L,24 h,P=0.000）和（28.63±1.12）%（80μmol/L,24 h,P=0.000）。G2/M期细胞的比例则随G0/G1期和S期细胞比例的变化而改变。塞来昔布这种对细胞周期的阻滞作用,主要发生在药物作用后的24h左右。倒置显微镜观察:塞来昔布处理后,Tca8113细胞生长明显受到抑制,细胞突起减少、皱缩、胞浆颗粒增加,部分细胞呈固缩状态,并可见少数细胞碎裂死亡。光学显微镜观察发现,随着塞莱昔布的浓度增加及培养时间的延长,细胞形态开始发生改变,出现细胞皱缩、胞体变小,核浆比例减小、核仁数目变少,胞浆内有空泡产生,并出现凋亡细胞。透射电镜下观察显示,随着塞来昔布浓度的增加及作用时间的延长,Tca8113细胞出现胞体变圆、细胞电子密度升高、细胞器变性、细胞核染色质浓缩等改变,但各部分膜结构完整,细胞表面绒毛消失脱落,为早期凋亡细胞,并可见到凋亡细胞前期与后期变化并存,药物进一步作用,则形成中、后期凋亡细胞,并形成大量凋亡小体。AO/EB荧光双染检测发现,塞来昔布处理后可见早期凋亡细胞,细胞被AO及EB双重染色,早期表现为细胞核被染色呈黄绿色荧光,浓聚成新月形或颗粒状,位于细胞的一侧;随着药物浓度增加和作用时间延长,细胞凋亡现象明显加重,表现为细胞核被EB深染呈桔红色,核固缩和偏位,细胞膜可见出芽、起泡以及太阳花形变化;严重时可见细胞坏死,坏死细胞体积增大,呈不均匀的橙红色荧光,轮廓不清、解体或接近解体。Annexin V-FITC/PI双标记法流式细胞术检测细胞早期凋亡结果显示,对照组24、48 h细胞早期凋亡率分别为0%及（0.93±0.11）%;塞来昔布40、80μmol/L处理24 h后的早期凋亡率分别为（3.86±0.23）%、（15.25±0.87）%;48h后早期凋亡率分别为（7.17±0.64）%和（20.06±1.06）%,与对照组相比,早期凋亡细胞增多有显著性意义（P均=0.000）。结论:COX-2抑制剂塞来昔布主要以剂量依赖的方式,通过抑制细胞周期进程、诱导凋亡的作用抑制Tca8113细胞生长、增殖,其作用机制有待进一步研究。三、COX-12抑制剂塞来昔布增强抗癌药物对人舌鳞癌Tca8113细胞的杀伤作用目的:研究COX-2抑制剂塞来昔布与抗癌药物联合应用后能否增强抗癌药物对人舌鳞癌Tca8113细胞的杀伤作用。方法:Tca8113细胞常规培养24h后,分别加入含有不同浓度的塞来昔布、CDDP及BLM培养液,其塞来昔布药物终浓度分别为2.5、5、10、20、40、80μmol/L,CDDP药物终浓度分别为0、3.125、6.25、12.5、50 mg/L,BLM药物终浓度分别为0、3.125、6.25、12.5、50mg/L,并以人肝癌Hep-G2细胞株作为塞来昔布敏感细胞系进行阳性对照。继续培养24、48、72 h后,采用噻唑蓝法（MTT）测定细胞OD值,计算细胞生长抑制率,计算上述药物对Tca8113细胞抑制作用的IC50,依据IC50选择塞来昔布作用的最佳药物浓度(药物浓度＜IC50)。本研究采用塞来昔布（10μmol/L）分别与CDDP（3.12、6.25、12.5mg/L）和BLM（3.12、12.5、50 mg/L）联合作用Tca8113细胞。培养24、48、72 h后,MTT测定联合用药对Tca8113细胞的细胞毒性作用,经S-N-K法统计学检验后,再用金正钧法计算q值,判断塞来昔布与抗癌药物联合应用后对Tca8113细胞的杀伤作用,当q=1±0.15为相加作用,q＞1.15为协同作用,q＜0.85为拮抗作用。同时采用流式细胞仪检测联合用药后对Tca8113细胞周期进程的影响,光镜下观察联合用药后Tca8113细胞的形态学变化。结果:小剂量的塞来昔布（10μmol/L）与CDDP、BLM联合应用后,其增强CDDP及BLM对Tca8113细胞的杀伤作用有显著性意义,塞来昔布与CDDP、BLM联合应用后对Tca8113细胞杀伤方面的相互作用,随时间变化而作用方式不同,在药物作用后24h以相加作用为主,48h以协同作用为主,而72h后又以相加作用为主。塞来昔布与CDDP及BLM联合应用后,可显著增强CDDP及BLM阻滞Tca8113细胞周期进程的作用,其阻滞G1期细胞进入S期的作用最为明显,导致G0/G1细胞的数量增加,S期及G2/M期细胞减少。G0/G1期细胞数量从抗癌药单用时的（58.53±1.00）%增加至（61.83±0.50）%（CDDP,P=0.001）,及从（56.5±0.96）%增加至（60.93±0.32）%（BLM,P=0.000）,S期和G2/M期细胞数量减少,S期细胞数量从（31.3±0.70）%减少至（29.63±0.64）%（CDDP,P=0.175）和（30.3±1.95）%减少至（30.57±0.78）%（BLM,P=0.849）,G2/M期细胞也随G0/G1期和S期细胞数量的变化而发生相应改变。结论:小剂量的塞来昔布即可增强CDDP及BLM对Tca8113细胞的杀伤作用,抑制细胞生长与增殖,增强对细胞周期进程的阻滞作用,其与CDDP和BLM联合应用后对Tca8113细胞的杀伤作用呈协同作用或相加作用。四、动物体内观察COX-2抑制剂塞来昔布联合顺铂的抗癌作用目的:进一步研究COX-2抑制剂塞来昔布单独应用或与抗癌药联合应用对Tca8113细胞裸鼠荷瘤的生长抑制作用。方法:将Tca8113细胞（2×106个细胞）接种于32只Balb/c裸鼠皮下,一周后,确认裸鼠皮下种植部位已成瘤后,将裸鼠随机分为4组:对照组、塞来昔布组、CDDP组及塞来昔布+CDDP联合用药组,每组8只。塞来昔布组采用灌胃给药,剂量为200mg/kg·d-1;CDDP组采用腹腔注射给药,剂量为5 mg/kg·w-1;塞来昔布+CDDP组采用塞来昔布(200mg/kg·d-1,灌胃)+CDDP(5 mg/kg·w-1,腹腔注射);对照组予腹腔注射生理盐水,口服灭菌蒸馏水。给药后每隔7天测量移植瘤的直径并计算体积。给药后35天处死裸鼠,测移植瘤质量,计算抑瘤率。光镜及电镜观察裸鼠移植瘤组织形态学及细胞超微结构变化;免疫组织化学检测移植瘤组织COX-2、VEGF-C蛋白的表达;荧光定量PCR检测各组移植瘤组织中COX-2、VEGF-C mRNA的表达,并通过析因方差分析检验塞来昔布和CDDP两药对裸鼠移植瘤生长、移植瘤组织中COX-2、VEGF-C mRNA表达的交互作用。结果:Tca8113细胞接种裸鼠皮下后的7天,注射点确认有肿瘤生长。从给药后14天开始,与对照组相比,各药物处理组移植瘤生长较慢,其中以塞来昔布+CDDP组移植瘤生长明显慢于对照组及单用药物组。实验终止时对照组移植瘤体积及瘤体质量明显大于其它各组,而塞来昔布+CDDP组移植瘤的体积及瘤体质量最小。对照组和塞来昔布组在不同时间之间瘤体体积变化有差异有显著性,说明随着时间的延长,移植瘤体积逐渐增大。但CDDP和塞来昔布+CDDP联合应用后不同时间之间差异无显著性意义,提示CDDP及塞来昔布+CDDP具有显著的抑制Tca8113细胞裸鼠移植瘤生长的作用。各实验组从第14天开始,与对照组相比,其抑制肿瘤生长作用有显著性意义。而塞来昔布+CDDP组联合应用的抑制移植瘤生长的作用,与CDDP单用相比,差异有显著性意义（P=0.034）,说明塞来昔布有增强CDDP抗肿瘤的作用。移植瘤质量结果表明,塞来昔布、CDDP及塞来昔布+CDDP组的抑瘤率分别为15.63%、37.5%及82.81%。通过析因方差分析方法对各实验组与对照组抑瘤情况分析,塞来昔布和CDDP抑制裸鼠Tca8113细胞移植瘤生长的主效应均有统计学意义（P=0.000）,二者交互作用显著（P=0.001）,说明两者在抑制裸鼠Tca8113移植瘤生长方面具有协同增强作用。移植瘤组织学光镜观察见:塞来昔布组肿瘤细胞凋亡现象多见,部分区域可见坏死灶;CDDP组表现为细胞变性和坏死,可以见到细胞肿胀、液化、质膜破裂,部分细胞出现核溶解、消失等表现,但凋亡细胞很少;塞来昔布+CDDP组则可见到肿瘤细胞大片凝固性坏死,并可见较多的凋亡细胞。透射电镜观察:塞来昔布组及塞来昔布+CDDP组均可见到凋亡细胞,但以塞来昔布+CDDP组凋亡细胞多见,表现为细胞皱缩、细胞器变性、电子密度升高、体积变小,但膜结构完整;核染色质浓缩,呈均质状、碎裂及核仁消失。免疫组织化学染色观察发现,对照组COX-2及VEGF-C蛋白均呈强阳性表达,塞来昔布及塞来昔布+CDDP组COX-2及VEGF-C蛋白的表达明显减弱。经析因方差分析对各实验组与对照组COX-2和VEGF-C mRNA表达循环域值（Ct）的倍比关系(2-ΔΔCt值)分析发现,塞来昔布抑制COX-2 mRNA表达方面的作用较弱,其与CDDP对COX-2基因表达的抑制方面无交互增强作用,提示选择性COX-2抑制剂塞来昔布对COX-2的抑制作用,可能主要表现在蛋白水平,抑制其酶的活性。但对VEGF-C基因表达方面,塞来昔布与CDDP主效应均有统计学意义,两者有交互增强作用。这也提示COX-2抑制剂单独应用或与CDDP联合应用后抑制肿瘤血管形成的作用,可能与抑制VEGF-C基因表达有关。结论:COX-2抑制剂塞来昔布单独应用,虽然与对照组相比其抑制Tca8113细胞裸鼠移植瘤生长的作用有显著性意义,但其抑制肿瘤生长的作用仍然较弱;其与CDDP联合应用后,抑制裸鼠移植瘤的生长有显著性意义,两者在抑制移植瘤生长方面有交互增强的作用。塞来昔布对COX-2 mRNA表达的抑制作用较弱,但对VEGF-C mRNA表达的抑制作用有显著性意义,与CDDP联合应用后,对VEGF-C mRNA表达的抑制呈交互增强作用。塞来昔布与CDDP联合应用后抑制移植瘤生长的同时,促进移植瘤组织的变性、坏死及诱导肿瘤细胞凋亡。塞来昔布抑制移植瘤生长的作用可能与抑制COX-2蛋白表达有关,其具体作用机制尚待进一步研究。总之,本研究发现,COX-2与VEGF-C在舌癌组织中呈强阳性表达,并与舌鳞状细胞癌的生物学行为密切相关,COX-2和/或VEGF-C可以作为临床判断肿瘤的侵袭性、转移潜能及估计预后重要的参考指标。选择性COX-2抑制剂塞来昔布主要以剂量依赖方式通过抑制细胞周期进程、诱导凋亡从而抑制人舌鳞癌Tca8113细胞生长。同时,塞来昔布能增强抗癌药CDDP和BLM对Tca8113细胞的杀伤作用,塞来昔布与CDDP、BLM联合应用后对Tca8113细胞的杀伤作用呈协同或相加作用。大剂量的塞来昔布(200 mg/kg·d-1)单独应用,能够抑制裸鼠Tca8113细胞移植瘤的生长,与CDDP联合应用后,能增强CDDP对裸鼠移植瘤的生长抑制作用。塞来昔布在抑制裸鼠移植瘤生长的同时,抑制肿瘤组织COX-2和VEGF蛋白的表达。塞来昔布与CDDP联合应用能增强抑制Tca8113细胞裸鼠移植瘤VEGF-C mRNA表达,两者之间有交互增强作用,而塞来昔布对COX-2 mRNA的表达则无明显抑制作用,其与CDDP联合应用后对COX-2 mRNA的表达无交互增强作用,提示COX-2抑制剂塞来昔布的抗肿瘤作用可能主要是抑制COX-2酶的活性。塞来昔布抑制裸鼠移植瘤生长的同时,促进移植瘤组织的变性、坏死及诱导肿瘤细胞凋亡。以上这些研究结果,为今后更深入研究COX-2与口腔癌的发生,以及选择性COX-2抑制剂在口腔癌的预防及治疗方面的作用,奠定了良好的工作基础。