长牡蛎SNP标记的开发及多态性检测

论文摘要

长牡蛎是重要的经济养殖贝类,良种化、抗逆性状及快速生长个体的培育是长牡蛎养殖业得以持续发展的基础。目前飞速发展的分子标记辅助育种技术为优良品种的快速培育提供了理论基础和实践经验。本研究以长牡蛎为主要研究材料,探讨了长牡蛎SNP标记的筛选和多态性评价。本研究利用已有长牡蛎EST库中的序列进行单核苷酸多态（SNP）标记开发。通过对长牡蛎（Crassostrea gigas）已有的EST序列数据库检索,经过序列聚类和拼接得到EST簇4548个,含有不少于4条EST序列的簇共1079个,经过进一步设置筛选条件,整理出可供利用的EST簇313个,得到候选SNP位点共计1140个。目前根据候选SNP位点共设计引物82组,通过片段长度差异等位基因特异性PCR（fragment length discrepant allele specific PCR,FLDAS-PCR）的分型方法,在一野生群体中进行检测和验证,结果共有17个SNP候选位点显示多态性,期望杂合度分布区间为0.088至0.506,观测杂合度分布区间为0.091至0.667;通过哈代-温伯格（HW）平衡、连锁不平衡检验,结果显示除3个SNP位点的差异显著（P值<0.05）,不符合HW平衡之外,其他14个位点没有明显的连锁不平衡。对含有17个SNP的EST的共同序列进行BlastX分析,推测其功能并确定开放阅读框,从而预测17个SNP的性质。本研究表明对于目前基因组学研究尚处在初级阶段的海洋生物物种,通过基于EST数据库的SNP开发是一条重要途径,可以有效弥补海洋生物基因组学滞后影响SNP标记开发的现状。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 综述
• 第一节 分子标记与单核苷酸多态性（SNP）
• 1.1.1 分子标记技术的发展
• 1.1.2 分子标记的应用领域
• 1.1.3 SNP 概述
• 第二节 SNP 标记开发概述
• 1.2.1 从已有的EST数据库中开发SNP标记
• 1.2.2 SNP 开发与生物信息学
• 1.2.3 SNP的检测方法
• 第三节 SNP分子标记在水产养殖动物中的应用
• 1.3.1 构建水产动物遗传连锁图谱
• 1.3.2 SNP 在群体遗传学中种群进化和亲缘关系的应用
• 1.3.3 SNP 在基因连锁不平衡、关联分析和功能学方面的应用
• 1.3.4 SNP 在牡蛎生物学研究中的应用
• 第四节 本研究的目的和意义
• 第二章 基于长牡蛎 EST 数据库获得候选 SNP 位点
• 前言
• 第一节 实验材料与方法
• 2.1.1 长牡蛎 EST 序列的获得
• 2.1.2 长牡蛎 EST 序列的聚类和拼接
• 2.1.3 从下载的 EST 文件中设置筛选 SNP 的标准
• 2.1.4 长牡蛎 SNP 位点类型的统计
• 2.1.5 含有长牡蛎 SNP 的 EST 功能推测
• 第二节 试验结果与分析
• 2.2.1 基于 EST 数据库开发的候选 SNP 数目及类型统计
• 2.2.2 SNP 类型统计
• 2.2.3 含有候选 SNP 位点的 EST 功能分析
• 第三节 讨论
• 第三章 利用 FLDAS-PCR 对候选 SNP 进行分型检测
• 前言
• 第一节 实验材料
• 3.1.1 DNA 模板制备及鉴定
• 3.1.2 主要试剂和主要仪器
• 第二节 实验方法
• 3.2.1 FLDAS-PCR 引物的设计方式及 FLDAS-PCR 原理
• 3.2.2 DNA 扩增及 SNP 分型
• 3.2.3 PCR产物检测
• 3.2.4 测序分析确认FLDAS-PCR结果
• 第三节 实验结果与分析
• 3.3.1 基因组 DNA 提取情况
• 3.3.2 EST-SNP 位点的 FLDAS- PCR 验证
• 3.3.3 测序分析确认结果
• 3.3.4 引物设计与优化
• 第四节 讨论
• 第四章 长牡蛎 SNP 位点群体多态性分析及功能预测
• 第一节 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 多态性分析方法
• 第二节 实验结果与分析
• 4.2.1 根据FLDAS-PCR 基因分型结果的基因型统计
• 4.2.2 基因型数据分析
• 4.2.3 17 个长牡蛎 SNP 位点的功能预测
• 第三节 讨论
• 实验总结
• 参考文献
• 致谢