论文摘要
肌肉发生是肌肉可塑性和肌肉发育的重要的生物学基础。狭义的肌肉发生最初是指在胚胎发育过程中,体节细胞经过一些列增殖、迁移、分化,最终形成肌肉组织的过程,广义的肌肉发生还包括了成体肌纤维的发生的内容,包括了成体干细胞（主要指卫星细胞）成长为成熟肌细胞、肌纤维核上调某些肌肉特异性结构、功能蛋白表达等过程。医学、农学、体育学的多方面研究都涉及到肌肉发生,如肌肉创伤、老年退行性少肌症和肌营养不良症的治疗、畜禽养殖、运动介导的肌肉适应性变化等。肌肉发生涉及了一系列复杂的分子事件,对细胞外信号系统如GH/IGF-1通路等已经有深入的研究,但是细胞内分子事件迄今为止我们仍对此知之甚少。p38/NF-κB/IL-6是近年来发现的肌肉发生的细胞内信号通路,自此发现以来就受到广泛的关注。运动条件下该通路的研究国内外未见报道,且肌肉发生也是体育研究中最重要的领域,因此本研究以此通路为主干进行研究,对其在运动中的动力学特征进行检测,并对其作用进行分析。具体来说,本研究的目的为:1、探索急性大、中强度运动后,肌肉发生通路因子p38、NFκB、IL-6和肌肉发生因子及辅助因子MRFs、MEF2c的相位变化,肌肉发生组织学微观指标卫星细胞数量和形态的变化及肌肉损伤组织学标志肌丝和Z线排列的变化。探讨上述运动方案中,p38、NFκB、IL-6在生物发生的作用、三者之间的信号联系、不同运动强度肌肉发生效果和机制的差异。2、D38/NFκB/IL-6进行逐级阻断,检测急性大强度运动后的NFκB蛋白总量、磷酸化水平、IL-6 mRNA及肌肉发指标——MRFs和MEF2c mRNA、卫星细胞数量和形态、损伤的组织学微观结构肌丝和Z线排列的变化。对p38/NFκB/IL-6的通路存在及各因子作用进一步确认。3、检测2周大强度运动后,p38蛋白水平、磷酸化水平、NFκB蛋白水平、磷酸化水平、IL-6 mRNA及肌肉发生生化指标——MRFs和MEF2c mRNA、肌肉发生的组织学微观结构指标——卫星细胞数量和形态、肌肉发生宏观指标——腓肠肌和体重、损伤的组织学微观结构肌丝和Z线排列的变化,探讨长期运动后p38、NFκB、IL-6在肌肉生物发生的作用、三者之间的信号联系、比较与急性运动的异同。本研究分为三部分,研究方法与结论如下。一、急性大、中强度运动对大鼠骨骼肌生物发生的影响方法:1、选用雄性SD大鼠66只,按体重分层后,每组6只,分为11组（尽量减小组间的体重的差异）:对照组（C1组）、急性大强度运动即刻组（H-0h组）、急性运动后1h组（H-1h组）、急性运动后6h组（H-6h组）、急性大强度运动后16h组（H-16h组）、急性大强度运动后24h组（H-24组）、急性中等强度运动即刻组（M-0h组）、急性中等运动后1h组（M-1h组）、急性中等运动后6h组（M-6h组）、急性中等强度运动后16h组（M-16h组）、急性中等强度运动后24h组（M-24组）。所有运动组适应性训练后,休息两天,开始一次1h的大强度或中等强度的运动。运动后取腓肠肌肌肉,检测p38蛋白总量、磷酸化水平（方法:WESTERN BLOTTING）、NFκB蛋白总量、磷酸化水平（ELISA）、IL-6 mRNA及肌肉发生生化指标——MRFs和MEF2c mRNA（方法:RT-PCR）、肌肉发生的组织学微观结构指标——卫星细胞数量和形态、损伤的组织学微观结构肌丝和Z线排列的变化（方法:透射电镜）。结果和结论:急性运动后,大强度运动后,p38活性、NF-KB活性、IL-6 mRNA上调时段（0-6h）一致,但是逐点检测变化趋势发现有不同不之处。MRFs mRNA在1-16h时段上调、MEF2c在1-6h上调。中等强度运动后,p38活性在0-6h、NF-KB活性在0-1h、IL-6mRNA在0-1h上调,MRFs 6h才开始上调,并且只有MyoD上调,MEF2c在0-1h上调。大、中等强度运动度运动后,Myf-5均不变。在相同相位点,大强度运动造成因子变化更剧烈。两种强度运动后卫星细胞形态没有显著变化。各因子上调时段的重叠情况及变化幅度、上调次序提示,p38/NF-KB/IL-6/MyoD、MyoG、MRF4、MEF2c可能是急性大而非中等强度运动介导肌肉发生重要通路,大强度对因子刺激更强烈,对于肌肉发生效果更明显。卫星细胞形态无显著变化提示,非损伤性的运动,卫星细胞激活较晚。损伤可能是运动激活卫星细胞重要因素而非必要前提,也可能说明,是肌纤维而不是卫星细胞是急性运动介导下p38/NF-KB/IL-6/MyoD、MyoG、MRF4、MEF2c信号通路活动的主要场所。二、p38/NF-κB/IL-6阻断对急性大强运动诱导肌肉发生的影响方法:选用雄性SD大鼠66只,按体重分层后,每组6只,分为11组（尽量减小组间的体重的差异）:急性运动即刻组（0h组）、急性运动即刻组+NF-κB阻断（0h/NF-κB组）、急性运动后1h组（1h组）、急性运动后1h组+NF-κB阻断（1h/NF-κB组）、急性运动后6h组（6h组）、急性运动后6h组+NF-κB阻断（6h/NF-κB组）、急性运动后6h组+p38阻断（6h/p38组）、急性运动后16h组（16h组）、急性运动后16h组+NF-κB阻断（16h/NF-κB组）、急性运动后24h组（24h组）、急性运动后24h组+NF-κB阻断（24h/NF-κB组）。检测NFκB蛋白总量、磷酸化水平、IL-6 mRNA及肌肉发生生化指标——MRFs和MEF2c mRNA、肌肉发生的组织学微观结构指标——卫星细胞数量和形态、损伤的组织学微观结构肌丝和Z线排列的变化,方法同上。结果和结论:本研究通过阻断技术进一步研究了p38/NF-κB/IL-6在急性运动介导下对肌肉发生发挥作用,得到肯定的结果。具体发现,p38阻断预处理能够降低运动后6h时刻NF-κB、IL-6、MRFs（Myf-5外）、MEF2c的mRNA水平;NF-κB阻断预处理能够降低运动后6h IL-6、MRFs（Myf-5外）、MEF2c mRNA水平,降低16h MyoG mRNA水平,上述均为大强度运动后各基因上调时段。这表明p38/NF-κB/IL-6在急性大强度运动后早期阶段确实可能发挥对MRFs和MEF2c的调节。但本研究采用阻断剂的结果应该被谨慎的看待;因为PDTC有抗氧化作用、p38对MRFs和MEF2有直接的调控作用、NF-κB/INOS/NO作用可能加速MyoD mRNA的分解,这些可能对p38/NF-κB/IL-6/MRFs、MEF2c通路判断有干扰。SB203580只能阻断p38α、β,骨骼肌同样高表达并在运动中会被激活的p38γ的作用无法体现,值得进一步研究。此外,活体信号通路阻断与细胞培养不同,实际即使是局部肌肉注射也无法保证阻断剂的作用局限于局部,是否是阻断剂对其他组织（如神经系统）的影响继而影响了肌肉指标的变化也需要考虑,阻断剂有多少能够作用与局部也是个问题。三、2周大强度对大鼠骨骼肌生物发生的影响方法:选用雄性SD大鼠18只,按体重分层后,每组6只,分为3组（尽量减小组间的体重的差异）:对照组（C2组）、2周大强度运动后48h组（48h组）、2周大强度运动48h组+NF-κB阻断（48h/NF-κB组）。检测p38蛋白总量、磷酸化水平、NFκB蛋白总量、磷酸化水平、IL-6 mRNA及肌肉发生生化指标——MRFs和MEF2c mRNA、肌肉发生的组织学微观结构指标——卫星细胞数量和形态、损伤的组织学微观结构肌丝和Z线排列的变化。检测手段同上。结果与结论:2周大强度运动能够使腓肠肌/体重质量增长、卫星细胞形态发生变化,上调p38、NF-κB活性、上调MyoD、Myf-5、MyoG、MEF2c mRNA水平,但不影响IL-6 mRNA水平。NF-κB阻碍了腓肠肌的增长幅度、上述运动诱导活性或基因表达量上升及卫星细胞形态学变化的幅度。这可能表明,长期规律性的大强度训练能够通过p38/NF-κB/?/MyoD、Myf-5、MyoG、MEF2c mRNA通路促进肌肉发生。本研究不支持IL-6参与了长期运动诱导肌肉发生能力改善的过程,但是这个结论需要谨慎看待。全文总结:1、急性大、中强度跑台运动均可引起p38、NF-κB的磷酸化水平、IL-6、MRFs和MEF2c的mRNA水平一过性上升,但组织学上,卫星细胞和肌丝排列、Z线排列没有明显变化。与中等强度相比,大强度运动后24h内,p38、NF-κB活性、IL-6 mRNA变化较为同步,呈现更明显的信号通路特征。大强度运动后上述因子变化幅度更大。2、p38和NF-κB的阻断引起相关指标的改变,确认急性大强度运动中,p38/NF-κB/IL-6/MEF2c和MRFs存在信号通路。3、长时间大强度运动提高MRFs、MEF2c mRNA基础值上调,卫星细胞核形态上趋于激活态,NF-κB阻断降低上述变化幅度,训练后p38、NF-κB磷酸化基础水平上调,没有提高IL-6基础值,这提示,长期运动介导下,p38/NF-κB改善肌肉发生能力可能不通过IL-6,但mRNA不等同于蛋白水平,因此该结论应该谨慎的看待。