论文摘要
β-葡萄糖苷酶属于水解酶类,它可以催化水解许多含有β-D-葡萄糖苷键的糖苷类物质,如苦杏仁苷、大豆异黄酮糖苷等。β-葡萄糖苷酶的应用非常广泛,可用于提高果蔬制品的天然风味,还可以提高大豆异黄酮的生物活性等。目前国内外已有利用微生物发酵法产β-葡萄糖苷酶的研究,但其产生菌主要为霉菌,由于霉菌的生长周期长,耗能较大,不利于工业化生产的实现。本研究应用微生物研究常规方法依次对β-葡萄糖苷酶高产菌株筛选、产酶优化、菌种鉴定、酶动力学、粗酶液的提取及酶解大豆异黄酮糖苷等工艺进行了研究。目的：筛选出1-2株产β-葡萄糖苷酶的细菌菌株,并利用其所产β-葡萄糖苷酶对大豆异黄酮糖苷进行转化,为大豆异黄酮苷元的酶法生产提供一个新酶源。方法：本研究利用选择性培养基选取不同原材料进行分离筛选,通过DNS法选取酶活最高的细菌菌株；利用单因素试验及响应面分析试验对产酶条件进行优化,并通过菌落形态观察、生理生化试验及16SrRNA序列分析进行菌种鉴定；利用硫酸铵沉淀、透析、超滤及DEAE-52离子交换色谱法对菌株产β-葡萄糖苷酶进行分离纯化并对其酶学性质进行研究；利用所产β-葡萄糖苷酶粗酶液对大豆异黄酮糖苷进行转化研究,通过单因素试验及正交试验确定酶用量、pH、温度、酶解时间的最佳配比。结果：1.从纳豆中筛选出一株高产β-葡萄糖苷酶的细菌菌株,试验编号为NX-3。NX-3菌株产β-葡萄糖苷酶的最佳培养基条件为葡萄糖1.5%,大豆蛋白胨2%,黄豆粉1%,KH2PO4 0.1%,NaCl0.5%,CaCl2 0.05%,MgSO4·7H2O 0.02%,发酵温度36℃,pH为7.0,发酵时间为42h,装液量50ml/300ml三角瓶,转速150r/min,酶活从110.1IU/mL提高至155.2IU/mL,提高了40%。鉴定NX-3菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。2.纯化后的酶液比活力由初始2.5 U/mg提高至25.3U/mmg,比活力提高了9.1倍,经SDS-PAGE确定NX-3菌株产β-葡萄糖苷酶的分子量为40KDa。NX-3菌株产β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为50℃,温度超过60℃酶稳定性变化较大；最适pH为5.0,pH在3-6范围内酶较稳定；金属离子Mg2+该酶的酶活有促进作用,K+、Ca2+对该酶的酶活基本没有影响,Ag+、Hg2+对该酶的酶活有抑制作用。3.当大豆异黄酮底物浓度为10g/L时,转化的最佳配比为酶：底物2.5：1,pH5.0,温度40℃,酶解时间2.5h。在此条件下测得大豆异黄酮糖苷转化率达到67.4%。结论：本研究筛选出一株高产β-葡萄糖苷酶的细菌菌株,缩短了产酶的发酵周期,减少资源浪费,有利于工业化生产,同时为大豆异黄酮糖苷的转化生产奠定了基础。