论文摘要
知母（RHIZOMA ANEMARRHENAE）和百合（BULBUS LILII）均为百合科植物,是我国民间常用的传统中草药,具有清热除烦、泻肺滋肾、养阴润肺以及清心安神的功效。知母百合药对由知母和百合两味中药组成,记载于东汉张仲景的《金匮要略》中,具有滋阴养肺,去火等临床疗效。本论文基于现代联用分析技术,以知母和百合两味中药为研究对象,从体内外成分分析入手,建立了一套用于中药体内外成分鉴别与药效成分初步筛选的方法与模式,并将这些方法及相关技术应用于中药全面质量控制与体内多成分药代动力学研究中。以知母百合药对中皂苷类成分、双苯吡酮类成分、蒽醌类成分和生物碱类成分为分析对象,运用HPLC-TOF/MS联用分析技术对中药体内外所含主要化学成分进行了分析鉴别,对主要化学成分的质谱碎裂规律进行了初步解析。一、知母药材化学成分分析的研究第一,采用飞行时间质谱对知母药材的化学成分进行定性鉴别与结构解析。得到的化合物精确分子量与建立的知母化学成分数据库做比对,鉴定出的21个化合物包括:18个皂苷类成分、3个双苯吡酮类成分。分析确认了已知活性成分的结构,并获取了它们的裂解规律。同时对其中一些未知成分进行了分析,通过与文献的对照,推测了其中一些未知成分的结构。知母皂苷类成分化学结构的主要区别在于其结构母核上的连接基团的种类和数目不同,大多数知母皂苷类成分其结构母核上的连接基团为-O-nG,-CH3, -OH, -OCH3等,这使得皂苷类成分在碎裂电压下裂解时,容易形成[M+H-n*162]+, [M+H-15]+, [M+H-18]+, [M+H-31]+的碎片离子。如果在知母皂苷类成分结构母核的C-5和C-6位置有一个双键,C-3位上连接有-OH基团,由于连接-OH的相邻C均为饱和烃形式,因此其很容易失去一分子水形成双键。对于脱水后的双键位置,从知母皂苷结构母核的共轭系统考虑,为保持结构母核的稳定性,只可能在C-3和C-4形成双键。在知母皂苷类成分的裂解碎片中,出现的[M+H-15]+, [M+H-31]+,多是由于从知母皂苷结构母核上失去-CH3, -OCH3中性碎片所得,根据结构母核的立体结构推断,失去的-CH3,-OCH3多是连接在C-15和C-22位上。对于C-23位有-OH的知母皂苷类成分,如知母皂苷F,在裂解时首先发生麦氏重排,如果在C-15位含有-OH,进行麦氏重排后,会再脱去一分子水;C-22、C-23键极不稳定易进行α裂解。其它裂解方式跟知母皂苷类化学成分的裂解方式类似。第二,采用HPLC-DAD-MS对知母药材中两种双苯吡酮类成分和五种皂苷类成分进行含量测定。在系统考察了色谱质谱条件和样品前处理方法的基础上,建立了采用HPLC-DAD-MS法同时测定知母中七个成分的含量测定方法;并对该方法进行了系统的方法学验证,方法学验证结果表明该含量测定方法可用于知母中七个成分的含量测定。将该方法应用于10个不同产地和批次的知母药材中七个成分的含量测定。首次实现HPLC-DAD-MS联用一个系统对知母药材中两类具有不同检测性质共七个成分的含量测定。本文所建立的分析方法专属、准确、灵敏、高效,为知母药材的质量评价提供了新的方法。第三,应用单四级杆质谱同时对知母药材中的七种有效成分做药动学研究。采用液-液萃取法进行血浆样品预处理,色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C18 （2.1×50 mm,1.8μm）;流动相为0.1 %甲酸水溶液-乙腈,梯度洗脱;采用正离子检测方式,SIM扫描模式。利用该法研究了SD大鼠灌胃给予知母提取液后七个主要成分的药物动力学行为。结果显示,知母提取液中知母皂苷E1和E的T1/2、Cmax和Tmax等参数均小于知母提取液中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ。说明知母皂苷E1和E的吸收和代谢速度要快于知母提取液中的其他成分。灌胃给药提取液后,知母中知母皂苷类成分的药-时曲线成双峰,这可能与肠肝循环有关。知母皂苷AⅢ的药动学参数中Tmax明显大于其它成分,显示吸收和代谢慢于其它六个成分。知母提取液灌胃给药后药物动力学结果提示,中药提取物混合给药的药效作用时间延长,显示中药中化学成分协同配伍作用的内涵。二、百合药材及知母百合药对化学成分分析的研究第一,通过采用飞行时间质谱对百合药材的成分进行定性鉴别与结构解析。得到的化合物精确分子量与建立的百合化学成分数据库做比对,鉴定得到五个化合物:2个皂苷类、1个蒽醌类和2个生物碱类成分。分析确认了五个成分的结构,并获取了它们的裂解规律。百合皂苷类成分化学结构的主要区别在于其结构母核的不同,百合皂苷1其结构母核为替告皂苷元,而百合皂苷2的结构母核为薯蓣皂苷元。这使得百合皂苷类成分在进行高电压裂解时,形成了不同的碎片离子。如果在百合皂苷类成分结构母核的C-5和C-6位置有一个双键,C-3位上连接有-OH基团,由于连接-OH的相邻C均为饱和烃形式,因此其很容易失去一分子水形成双键。对于脱水后的双键位置,从百合结构母核的共轭系统考虑,为保持结构母核的稳定性,只可能在C-3和C-4形成双键。在生物碱类成分的裂解碎片中,出现的[M+H-28]+,[M+H-28-59]+,多是由于从结构母核上失去-CO和侧链中性碎片所得,根据结构母核的立体结构推断,失去的-CO和侧链多是为了形成一个更彻底芳香化的结构。第二,通过采用飞行时间质谱对知母百合药对的所有成分进行定性鉴别与结构解析。鉴定出的30个化合物包括:24个皂苷类成分、3个双苯吡酮类成分、1个蒽醌类成分和2个生物碱类成分。阐述加入百合后对知母的物质基础的影响,发现了4个新的知母皂苷类成分:知母皂苷I、知母皂苷AI、知母皂苷G和知母皂苷D,并通过大量的特征碎片离子分析了其结构、获取了裂解规律。发展建立了一个用于复杂中药体系中的药对及复方进行快速准确分析的研究方法与模式。大多数知母皂苷类成分其结构母核上C-15和C-22位上的连接基团为-O-nG,-CH3,-OH,-OCH3等,因而在进行高电压裂解时,易形成[M+H-n*162]+, [M+H-15]+, [M+H-18]+, [M+H-31]+的碎片离子。对于C-23位有-OH的知母皂苷类成分,在裂解时首先发生麦氏重排。其它裂解方式跟知母皂苷类化学成分的裂解方式类似。在百合皂苷类成分结构母核的C-5和C-6位置有一个双键,C-3位上连接有-OH基团,由于连接-OH的相邻C均为饱和烃形式,因此其很容易失去一分子水形成共轭双键。蒽醌类成分的裂解是典型的C16、C20并合吡啶5-孕甾烯类化合物的裂解模式,主要是通过失去侧链糖基和-CH3后产生特征碎片离子。第三,应用单四级杆质谱同时对知母百合药对中的七种成分做比较药物动力学研究。合用百合后,根据知母皂苷类成分和双苯吡酮类成分在大鼠体内药动学参数进行组间t检验的统计分析结果发现,五个知母皂苷类成分在大鼠体内的这些药动学参数的差别具有显著意义。知母百合药对提取液的T1/2、Tmax、Cmax和AUC等参数均小于知母提取液,但CL/F值大于后者。这表明知母百合药对中七个成分的吸收和代谢速度要快于知母提取液中的七个成分,两者合用能够提高皂苷类成分和双苯吡酮类成分的吸收。灌胃给药提取液后,知母中知母皂苷类成分的药-时曲线成双峰,这可能与肠肝循环有关。关于知母和百合的药动学研究很多,但是到目前为止没有关于两者配伍后对主要药效成分体内吸收影响的文献报道。本文研究结果表明,知母和百合的配伍改变了七个有效成分的某些药动学参数,这种现象可能是由于百合的加入促进了皂苷类成分的吸收,从而影响了知母中有效成分的药动学行为,知母百合药对的配伍增效作用机制有待进一步深入研究。
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