水稻染色质调控因子功能分析

论文摘要

染色质调控因子主要分为两大类：一类是染色质修饰因子,主要包括DNA甲基化酶以及组蛋白修饰酶；第二类是除了这些酶以外与表观遗传调控相关的因子,包括能够识别特定修饰位点的蛋白以及染色质变构因子等等。目前在水稻中对于染色质调控因子特别是第二类的研究相对较少,因此研究水稻这些基因的功能对于阐明水稻表观遗传调控的分子机理具有重要意义。本研究主要以水稻的三类基因CHD （Chromodomain Helicase DNA-binding protein）类、LHP1（LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1）以及组蛋白去乙酰化酶HDAC11（histone deacetylase 11）为研究对象,通过克隆、转化以及酵母双杂交等方法研究了它们在表观遗传调控中的作用,主要得到以下结果：1.对水稻SNF2家族的基因进行了进化树分析,并确定了水稻CHD类基因。2.对CHD类的基因构建了RNA干涉（RNAi）载体并转化水稻受体得到了转基因植株,对部分植株进行了检测,找到了CHD基因的突变体并进行了基因型验证以及表达量的检测。3.CHD1在叶片中的表达量相对较高,特别是在嫩叶中,其表达量是其它部位的几十倍,即使在成熟的叶片中其表达量较其它部位也要高出许多。4.CHD1的RNAi转基因植株与突变体出现相同的表型,主要表现在：植株矮小、茎秆变细、叶片包括营养叶和剑叶变窄但长度变化不大、叶片上表面泛白、种子变窄、在大田中种植根明显减少变短。5.chd1突变体叶片的各种组织或者细胞包括大、小维管束、泡状细胞以及叶肉细胞等数目都变少,在茎杆中细胞的数目也明显减少,而顶端分生组织的细胞大小和数目均没有变化。突变体叶片上的表皮毛的数目明显增多,而且叶片叶绿素的含量明显降低。6在chd1突变体中WEE1表达量明显上升,但是只是在田间种植的叶片中有上升,在其它的部位包括芽、苗和茎均没有变化。WEE1的表达模式正好与CHD1互补,其在叶片中表达量相对较低,特别是在成熟叶片中基本没有表达,而在其它部位表达量较高。7在水稻中WEE1的表达明显受到DNA诱变剂MMS的诱导,但是这种诱导也仅仅局限于叶片中。而MMS的处理会使CHD1的表达量下降。8 chd1突变体对MMS较野生型更为敏感,而相同浓度的MMS处理在chdl中的WEE1的表达高与野生型没有明显的差别。9对chd1突变体进行了全基因组芯片分析发现在突变体中有大量的与胁迫相关的基因均不同程度地上升表达。10一些组蛋白修饰包括H3K4三甲基化和H3K27三甲基化在chd1突变体中没有明显的变化,而且CHD1突变以及MMS处理对WEE1的H3K27三甲基化没有影响。11 CHD1蛋白的PHD锌指结构域可以在体外与三甲基化H3K27结合,两个串联的chromodomain也可以与组蛋白结合,但是没有与特殊修饰位点结合的特异性。12对LHP1在水稻体内进行了RNAi干涉,但是在检测的阳性植株中没有发现明显的表型变化,水稻LHP1具有不同的剪切体,并且在籼粳两个不同的亚种中剪切体也有所不同；LHP1在水稻各个部位均有表达；酵母双杂交实验结果证明LHP1的chromoshadow可以产生同源二聚体。13用酵母双杂交的方法筛选水稻HDAC11的互作蛋白,找到了一个水稻特异的基因,这个基因没有保守的结构域,在其它物种也没有同源的蛋白；这个基因在籼粳亚种之间还表现多态性,其中有些引起了氨基酸的改变,有些则没有,而22位的胸腺嘧啶的缺失导致该基因在籼稻中翻译提前终止；这个蛋白的N端不参与它与HDAC11的互作；它与HDAC11的表达谱相似,在水稻各个部位均有表达。这一系列的结果表明水稻CHD1参与DNA损伤的信号传导。当DNA损伤时,CHD1会将信号传递给WEE1,暂时抑制它的表达,从而延缓细胞周期的进行,这也揭示了表观遗传调控在细胞周期调控中的重要作用。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 表观遗传学概述
• 1.1.1 表观遗传学定义
• 1.1.2 表观遗传学与经典遗传学
• 1.2 表观遗传调控分子机制
• 1.2.1 真核生物染色质的结构
• 1.2.2 DNA甲基化
• 1.2.3 组蛋白修饰
• 1.2.4 表观修饰信号的识别
• 1.2.5 其它机制
• 1.3 染色质变构因子
• 1.4 细胞周期调控
• 1.4.1 细胞周期调控的研究
• 1.4.2 植物的细胞周期调控的研究
• 1.4.3 表观遗传调控细胞周期
• 2. 材料和方法
• 2.1 水稻材料
• 2.2 载体及构建
• 2.3 菌株
• 2.4 水稻SNF2基因序列的分析
• 2.5 遗传转化
• 2.6 RNA抽提、RT-PCR、定量PCR和Northern杂交
• 2.7 DNA的抽提以及突变体的基因型鉴定
• 2.8 组织切片
• 2.9 叶绿素的测定
• 2.10 组蛋白的抽提和western blot
• 2.11 水稻全基因组基因芯片分析
• 2.12 染色质免疫共沉淀
• 2.13 体外组蛋白结合实验
• 2.14 酵母双杂交
• 2.15 MMS处理
• 3. 结果与分析
• 3.1 水稻CHD基因的序列分析与转基因材料的获得
• 3.1.1 水稻CHD基因的序列分析
• 3.1.2 遗传转化材料的获得
• 3.2 转基因材料分析与CHD1功能研究
• 3.2.1 CHD1的基因结构分析以及cDNA全长的分析
• 3.2.2 CHD1的表达模式
• 3.2.3 chd1突变体和CHD1 RNAi转基因植株出现相同的表型
• 3.2.4 chd1植株叶片和茎的细胞数目减少
• 3.2.5 chd1植株叶片上表面表皮毛增多且叶片的叶绿素含量下降
• 3.2.6 WEE1在chd1中的表达量上升
• 3.2.7 水稻WEE1和CHD1对DNA诱变剂MMS呈现相反的表达变化
• 3.2.8 chd1突变体中WEE1的上升表达仅在田间种植的叶片中发生
• 3.2.9 chd1较野生型对MMS更敏感
• 3.2.10 DNA损伤早期诱导的基因在chd1中的表达量没有变化
• 3.2.11 chd1植株全基因组芯片分析
• 3.2.12 western blot检测chd1植株各种组蛋白修饰的变化
• 3.2.13 CHD1的PHD结构域可以在体外与H3K27me3结合
• 3.3 水稻LHP1的功能分析
• 3.3.1 水稻LHP1基因的结构以及cDNA全长的获得
• 3.3.2 LHP1的表达谱分析
• 3.3.3 LHP1的chromoshadow结构域可以形成二聚体
• 3.3.4 LHP1 RNAi转基因植株没有表型
• 3.4 HDAC11的互作蛋白的筛选
• 3.4.1 酵母双杂交筛选HDAC11的互作蛋白
• 3.4.2 筛选出来的蛋白为水稻特异基因并在籼粳之间存在多态性
• 3.4.3 重新转化验证互作
• 3.4.4 HDAP蛋白的N端不参与与HDAC11的互作
• 3.4.5 HDAP与HDAC11的表达谱分析
• 4. 讨论
• 4.1 CHD1在DNA损伤信号传导中的作用
• 4.2 水稻LHP1可能有别于拟南芥同源基因的功能
• 4.3 CHD1抑制基因的表达可能需要H3K27的三甲基化
• 4.4 CHD1可能在水稻发育中也具有重要作用
• 参考文献
• 附录Ⅰ 部分实验的操作流程
• 附录Ⅱ 作者简历
• 致谢